近期，TwistDx推出了一系列全新的液態(tài)重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA)試劑盒，這些試劑盒非常適合需要不使用熱循環(huán)儀就能在15分鐘內(nèi)完成 DNA/RNA 擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)室以及想要靈活構(gòu)建試驗(yàn)體系的研究人員使用。

 

 

TwistAmp® Liquid試劑盒提供經(jīng)甘油穩(wěn)定化處理的液態(tài)RPA試劑，該形態(tài)對(duì)于在實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行 PCR 和其他基于酶的反應(yīng)的任何人來(lái)說(shuō)都非常熟悉。這些試劑各自裝于單獨(dú)的試管中，用戶可隨意從中移取任何量的酶混合液來(lái)構(gòu)建自己所選的RPA反應(yīng)體積，配制用于多次反應(yīng)的預(yù)混液，或者以各種 RPA 組分比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化試驗(yàn)。

 

除了具有室溫穩(wěn)定性的凍干態(tài)TwistAmp® RPA試劑盒這一旗艦產(chǎn)品，本次新推出的 TwistAmp® Liquid試劑盒是現(xiàn)場(chǎng)或定點(diǎn)試驗(yàn)開(kāi)發(fā)的理想之選。液體形態(tài)讓實(shí)驗(yàn)室更容易地在日常工作中使用快速簡(jiǎn)單的RPA法（該方法有時(shí)甚至采用與PCR相同的引物）取代 PCR法，以及更容易地開(kāi)發(fā)出定制的試驗(yàn)。

 

 

◆ 100 µl 50x 外切酶 III (TwistAmp® Liquid exo/exo RT kits);

◆ 100 µl 50x 逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT) (TwistAmp® Liquid Basic RT/exo RT kits);

◆ 100 µl of 陽(yáng)性對(duì)照模板 (DNA with TwistAmp® Liquid exo/Basic kits, RNA with TwistAmp® Liquid Basic RT/exo RT kits);

◆ 45 µl of 陽(yáng)性oligo mix (oligo mix consists of primers for Basic/Basic RT kits, primers plus a fluorescently labelled exo probe in the exo/exo RT kits)

◆ ddH2O; dNTPs; 寡聚核苷酸; RNase抑制劑(僅用于RT試劑盒)

 

 

A在低溫保存時(shí), 重組酶和輔助蛋白在50%甘油中20x核心反應(yīng)mix中有時(shí)會(huì)發(fā)生可逆的共沉淀反應(yīng).所以在室溫融化混勻后離心使其返回溶液形式并不影響其功能。

A 可以。Oligos, 2x Reaction Buffer, water, dNTPs and 10x E-mix可以預(yù)先混合，置于冰上幾個(gè)小時(shí)，在很多實(shí)例中可以過(guò)夜保存（性能上有任何改變都需要客戶自行實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)）。一旦加入20x核心酶，短期保存在冰上也是可以的。

A 先將RNA模板和醋酸鎂混合后加入反應(yīng)體系中，RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，所以加入RNA和醋酸鎂時(shí)，將兩者分別加到在管內(nèi)壁兩側(cè)或者將醋酸酶加在管內(nèi)蓋中，同時(shí)離心混入體系，這種操作會(huì)提高反應(yīng)性能。

A 可以。少量磷酸肌酸會(huì)發(fā)生沉淀不會(huì)影響RPA反應(yīng)，只需在實(shí)驗(yàn)前通過(guò)渦旋將沉淀重懸離心即可。

A 可以，請(qǐng)參考

http://dx.doi.org/10.7150/thno.15250 和 http://dx.doi.org/10.1186/s13148-015-0100-6

A 最小低至PL級(jí)，請(qǐng)參考

 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0153359

A 1.8mM(總)dNTPs 作為起始量即可。用戶也可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)優(yōu)化濃度,有時(shí)1-12mM均適用。

A 優(yōu)化擴(kuò)增曲線考慮以下因素: 對(duì)于低拷貝數(shù)模板，不穩(wěn)定擴(kuò)增可能是因?yàn)檫_(dá)到檢測(cè)限或者是反應(yīng)混勻程度不同（未混勻的反應(yīng)擴(kuò)增效率不佳）。另外，在低溫情況下存貯，重組酶和輔助蛋白在50%甘油情況下形成沉淀,也是可能導(dǎo)致不穩(wěn)定擴(kuò)增的原因。所以，20x核心反應(yīng)mix在室溫下解凍并震蕩渦旋將使其成為液體，不影響其功能,并且有效提高擴(kuò)增效率。不穩(wěn)定擴(kuò)增也可能是因?yàn)閙aster mix量不足，在加入體系前，用戶必須保證震蕩后20x核心反應(yīng)組分均一。