近日，David Julius和Ardem Patapoutian因發現溫度和觸覺感受器而被授予2021諾貝爾生理學或醫學獎。David Julius團隊在感覺神經纖維上發現了被熱、冷或化學刺激物激活的離子通道，提供了對熱感覺、疼痛和瘙癢過程的分子級洞察。離子通道是一類物質交換的膜蛋白，其中有一種TRPA1離子通道，又稱芥末受體（wasabi receptor），是特異表達于初級傳入神經元（感覺神經元）上的跨膜受體。記得第一次吃芥末的那種酸爽嗎？就是它的作用! 更關鍵的是TRPA1被認為是治療慢性疼痛和瘙癢的潛在靶點。
   
2019年David Julius課題組在《Cell》雜志發表題為A Cell-Penetrating Scorpion Toxin Enables Mode-Specific Modulation of TRPA1 and Pain的文章，找到了來自于澳大利亞黑石毒蝎毒液的一種特異高效的TRPA1激動劑，并揭示了其作用機理，這種激動劑是被稱之為“芥末受體毒素”（WaTx）的多肽。
 
激動劑WaTx的結合機理
脂質體融合實驗發現WaTx能夠深入細胞膜，與TRPA1的胞內段結合。那結合位點在哪里呢？NMR結構解析發現，TRPA1胞內段還真的有一個口袋可能結合WaTx（如圖1所示）。
   
離子通道與拮抗劑/抑制劑（可能是一種毒素或者藥物）的相互作用是揭示其機理重要的一步，而BLI（生物層干涉）技術是最直接的檢測兩者相互作用的方法，使用BLI技術檢測WaTx和TRPA1的互作是必要的。
 
不過問題又來了，離子通道蛋白是一種膜蛋白，其表達純化一般很困難，即使能表達也只表達某一段（比如胞外段）。并且膜蛋白的緩沖液也是比較苛刻的，一不小心就全軍覆沒。如果能用膜提取物取代純化的蛋白做相互作用，就可以解決很多包括各種膜受體和離子通道的親和力檢測問題了。賽多利斯Octet®分子互作分析系統基于BLI技術，能夠檢測濃度很低的TRPA1粗提物。
 
使用Octet®檢測TRPA1粗提物
作者在用BLI檢測前，先算了一筆賬，如果細胞的濃度為2×10⁶/mL，一個細胞上大概有1000個離子通道。那么阿伏伽德羅常數一除，這些細胞懸浮液的膜提取物中TRPA1的濃度約為 (2×10⁶×1000×1000)/(6.02×10²³) = 3.3×10⁻¹²，大概為pM級別。考慮到膜提取的損失，就定為1 pM吧。這些數字不是拍腦袋想出來的，是通過電生理方法驗證過的。即使在如此低的濃度下，只要親和力高，用Octet®也是可以檢測出來的。
作者用SA（鏈霉親和素）傳感器固化Biotin-GSGS-WaTx，然后與表達人TRPA1細胞的膜提取物（總蛋白濃度為0.5 mg/mL）結合解離，結果如圖2所示：
  如果設定TRPA1的濃度為1 pM，KD值為0.33 pM。可見，親和力是非常高的，說明WaTx可以和TRPA1在體外發生直接而牢固的相互作用。
 
動物實驗證明了WaTx導致了因受體活化而引起的鈣離子通透性降低，從而抑制了神經多肽CGRP的釋放，也因此阻斷了神經炎癥的發生。
 
這位諾貝爾獎獲得者為什么會使用Octet®呢？

• 非標記Direct binding是趨勢，它的結果更準確
• 快速測定親和力，更好地對互作進行定量表征
• 使用浸入即讀的檢測模式，相對于傳統儀器，不受微流路限制，對粗樣品耐受性高，本文就是膜提取粗樣品
• 列入《美國藥典》的分子互作分析方法，文章多，認可度廣
• 使用方便，成本相對低

 
當然2020年兩位諾貝爾獎獲得者也用到了Octet®，請看下面鏈接。
告別EMSA，試試CRISPR女神用的核酸互作神器
諾獎獲得者教你做分子互作競爭實驗

參考文獻
A Cell-Penetrating Scorpion Toxin Enables Mode-Specific Modulation of TRPA1 and Pain . Cell，2019