當前，類器官研究如火如荼。這種在體外用3D培養技術對干細胞或器官祖細胞進行誘導分化形成的在結構和功能上都類似目標器官或組織的三維細胞復合體，包含多種細胞類型，突破了細胞間單純的物理接觸聯系，形成了更加緊密的細胞間生物通信，細胞間相互影響、誘導、反饋，協作發育并形成具有功能的迷你器官或組織，能更好地模擬器官組織的發生過程及生理病理狀態，因而在基礎研究以及臨床診療方面具有廣闊的應用前景^[1][2]。由誘導多能干細胞(iPSCs)產生的3D人腦類器官為研究大腦發育、疾病等提供了巨大的機會，這種腦組織體外三維培養系統是更好地理解發育性腦障礙發病機制的有力工具。由大腦類器官發育出各種不同的類腦區，組織形成離散區域，并能夠相互影響，從而幫助我們了解腦組織細胞的多樣性、復雜的相互作用和神經元網絡^[3]。
 
眼睛的發育是一個復雜的過程，了解它可為早期視網膜疾病治療奠定基礎。其中，研究視神經泡至關重要，因為視神經泡是眼睛的原基，其近端連接到前腦，為眼睛正常形成的關鍵環節。然而從多能細胞分化出來的離體視網膜類器官不能形成類似體內的視神經泡和視網膜上皮細胞層，這可能是因為離體視網膜類器官缺乏前腦（一種與視網膜發生發育相關的非視網膜類型組織^[4]）。
 
胚胎發育過程中，視泡由間腦通過器官發生多個階段發育而來（圖1A）。那么能否讓大腦類器官像人胚胎發育般，組裝產生兩側對稱的視神經泡成為巨大挑戰。利用iPSCs衍生的人腦類器官能否打破這個障礙？近期，杜塞爾多夫海因里希·海涅大學Jay Gopalakrishnan等人發表在 Cell Stem Cell上的一篇研究報道^[5]，成功讓夢想照進現實。
 
快來看看作者是如何設計實驗并借助哪些神器最終實現“迷你大腦長眼睛了……”
 
   作者首先修改了多能干細胞誘導分化方案。從使用低密度的細胞數開始，并在神經外胚層擴張期加入0-120nM醋酸視黃醇。添加60nM的醋酸視黃醇可重復在第30天左右誘導產生色素結構（pigmented structures），并分布于大腦類器官的一極(圖1B)。作者繼續通過免疫熒光染色及使用徠卡共聚焦SP8多色熒光成像，研究色素結構區域的眼睛相關生物標志物。共聚焦圖像顯示該區域的RAX, Pax6和FOXG1免疫熒光信號呈陽性(圖1C-D)。還觀察到突出的SOX2陽性內陷區，顯示VSX2和FOXG1梯度表達，表明類器官的視覺區域與前腦區分離(圖1E-G)。并結合單細胞測序來進行細胞多樣性的研究。
  持續培養類器官，色素區域在50 ~ 60天內逐漸發育形成1 ~ 2個深色的視神經囊泡樣結構，作者稱這些器官為視泡腦類器官(OVB-organoids)。通過單細胞測序、轉錄組學比對及免疫熒光染色、徠卡共聚焦顯微成像雙重驗證。發現OTX2陽性核在RPE細胞附近形成一層狀結構，在更深的組織中也呈梯度表達。在一些情況下，OTX2陽性的細胞核，ONECUT2信號呈陽性，BRN3也呈陽性并顯示出RGCs的層狀結構(圖2A-B-C)。并隨后分析了早期視網膜發生的確定生物標志物，包括VSX2(神經視網膜祖細胞)、Recoverin、CRX和NRL，并以視網膜類器官進行對照。相比OVB類器官，視網膜類器官呈典型球形(圖2D)。OVB-organoids中的觀察結果在某種程度上與Capowski的1期和2期視網膜organoids中觀察到的結果相似，這表明OVB-organoids包含有用于光受體發育的細胞。通過F-actin和Arl13b標記外層細胞膜和初生纖毛，共聚焦圖像顯示有組織的色素細胞呈現典型的蜂窩狀形態，每個細胞都含有初生纖毛(圖2K)。
 
然后作者研究了OVB類器官是否含有原始晶狀體和角膜上皮樣細胞等來自于表面外胚層的非神經元細胞類型。共聚焦圖像顯示位于每個視神經囊泡內的雙側aA/ ab -晶體蛋白陽性(圖3A)，這些結構被一層F -actin和Keratin-3陽性柱狀上皮細胞包圍，表明原始角膜上皮樣層與晶狀體樣結構相鄰(圖3B)。超微結構觀察到一個明顯的圓形結構，可能是前房被原始細胞所包圍角膜樣上皮(圖3C-D)。并在視神經泡附近發現了PCP4陽性，PCP4陽性細胞呈典型的體細胞形態，軸突延伸至100mm，穿透出視神經囊泡，從器官前部向后部遷移，表明陽性神經元可能已經從視泡遷移到更高階的視覺區域(圖3 E-F)。綜上所述，作者成功設計出具有雙側對稱視泡的大腦器官，并具有復雜產前眼發育的各種細胞類型(圖3G)。
  最后，作者結合轉錄組學數據，推斷OVB類器官具有皮質神經元突觸成熟特征并加以驗證。共聚焦結果顯示OVB表達Synapsin1陽性，成熟神經元標志物CTIP、髓鞘堿性蛋白(MBP)和層粘連蛋白等(圖4A-B-C-D)。為了證實功能性神經元的存在，作者還進行了全細胞膜片鉗記錄，在OVB類器官的神經元細胞中可檢測到明顯的自發動作電位，并發現自發動作電位對豚毒素(TTX)有時敏感、有時抵抗，說明神經元細胞具有成熟功能，并設計光感實驗做了進一步探索。