實時熒光定量 PCR技術原理與應用
實時熒光定量 PCR技術原理與應用
聚合酶鏈式反應 ( PCR) 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增 。在擴增反應結束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過 放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析 。無論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經 PCR 信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術應運而生。所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行， PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖 ( 如圖 1) 。
圖 1 實時熒光擴增曲線圖
一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段 , 熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加。 PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的 PCR 產物量不能計算出起始 DNA 拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段， PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是 3-15 個循環的熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數被稱為 CT 值（ threshold value ）（如圖 2 所示）。
圖 2. 熒光定量標準曲線
CT 值與起始模板的關系研究表明，每個模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多， CT 值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表 Ct 值（如圖 3 所示）。因此，只要獲得未知樣品的 Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
圖 3 閾值線和 CT 值
熒光探針和熒光染料
實時熒光定量 PCR 的化學原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。
1．SYBR Green I
圖 4 SYBR GREEN I 工作原理
SYBR Green I 是一種結合于小溝中的雙鏈 DNA 結合染料。與雙鏈 DNA 結合后，其熒光大大增強。這一性質使其用于擴增產物的檢測非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm ，發射波長最大約為 520nm 。 在 PCR 反應體系中，加入過量 SYBR 熒光染料， SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。圖 4. SYBR GREEN I 工作原理
SYBR Green I 在核酸的實時檢測方面有很多優點，由于它與所有的雙鏈 DNA 相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質，通過熔點曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚體，因而可以、區分非特異擴增，進一步地還可以實現單色多重測定。此外，由于一個 PCR 產物可以與多分子的染料結合，因此 SYBR Green I 的靈敏度很高。但是，由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產物的影響 1 。由解鏈曲線來分析產物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結果。
2．分子信標（molecular beacon）
分子信標是一種在靶 DNA 不存在時形成莖環結構的雙標記寡核苷酸探針。在此發夾結構中，位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結構中，熒光基團被激發后不是產生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（ FRET ）。由于 " 黑色 " 淬滅劑的存在，由熒光基團產生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團是淬滅劑，其釋放能量的波長與熒光基團的性質有關。分子信標的莖環結構中，環一般為 15-30 個核苷酸長，并與目標序列互補；莖一般 5-7 個核苷酸長，并相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設計，以致于在復性溫度下，模板不存在時形成莖環結構，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標的構象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，它發出自身波長的光子（圖 5 ）。
圖 5. 分子信標工作原理
3．TaqMan 探針
TaqMan 探針是多人擁有的專利技術。 TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的 5’ 末端，而淬滅劑則在 3’ 末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與 3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的 5’ 外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。 TaqMan 探針適合于各種耐熱的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。
圖 6. Taqman 探針工作原理
4. LUX Primers
LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物 3’ 端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發夾結構，使熒光淬滅。在沒有目標片斷的時候，引物與模板配對，發夾結構打開，產生特異的熒光信號（如圖 7 ）。
圖 7.LUX 引物工作原理
與 Taqman 探針和分子信標相比， LUX 引物通過二級結構實現淬滅，不需要熒光淬滅基團，也不需要設計特異的探針序列。因為 LUX 引物是一個相對較新的技術，所以其應用還有待實踐的檢驗。
實時熒光定量 PCR技術的應用
實時熒光定量 PCR 技術是 DNA 定量技術的一次飛躍。運用該項技術，我們可以對 DNA 、 RNA 樣品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外我們還可以對 PCR 產物或樣品進行定性分析：例如 利用熔解曲線分析識別擴增產物和引物二聚體，以區分非特異擴增；利用特異性探針進行基因型分析及 SNP 檢測等。 目前 實時熒光 PCR 技術已經被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域。其中最主要的應用集中在以下幾個方面：
1. DNA 或 RNA 的絕對定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的檢測 , 轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測， RNAi 基因失活率的檢測等。
2. 基因表達差異分析。例如比較 經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及 cDNA 芯片或差顯結果的確證
3. 基因分型。例如 SNP 檢測，甲基化檢測等。
隨著實時熒光定量 PCR 技術的推廣和普及，該技術必然會得到更廣泛的應用。
