高靈敏度化學發(fā)光技術應用心得
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槽轉印 |
半干轉印 |
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靈活性 |
可靈活選擇電壓設置、轉印時間和冷卻方法；可靈活更換電極位置（Trans-Blot和Trans-Blot Plus 印跡槽） |
快速、高強度轉印，使用少量
電轉印緩沖液，無冷卻系統(tǒng) |
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定量和定性結果 |
小分子量范圍可以
提供高效而定量的蛋白轉印 |
小分子量蛋白與印跡膜很少結合，
發(fā)生轉印并穿透印跡膜 |
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分子量范圍 |
寬分子量范圍 |
對于分子量大于120kD蛋白的轉印效率不穩(wěn)定，小分子量蛋白會轉印穿透印跡膜 |
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轉印時間 |
可以在不耗盡緩沖液時延長轉印時間到24h；高強度轉印只需15-60min |
快速轉印；不適用于延時轉印 |
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溫度控制 |
冷卻芯和循環(huán)冷卻水，可以在很低的溫度進行轉印（4-10℃），
例如原酶轉印 |
無冷卻系統(tǒng) |
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緩沖能力 |
緩沖液10-12L（Trans-Blot槽）或450ml（Mini Trans-Blot槽）緩沖液不限制轉印時間 |
少量，每次實驗只需要250ml，
節(jié)約試劑成本和縮短轉印時間 |
在轉印過程中將產生大量熱量，因此對電場強度要有一定的限制。轉印中產生的焦耳熱（Joule）與電源參數P成正比，P=I*V=I2R。電泳轉印緩沖液的溫度隨著焦耳熱的增加而升高，此時其電阻卻明顯下降。電阻的降低將會使轉印過程和電場強度發(fā)生變化，從而影響電轉印緩沖液的緩沖能力。同時，系統(tǒng)過熱還會引起凝膠的損壞或與印跡膜發(fā)生粘連。從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉印效率。
本室主要以濕轉進行轉印，因此本文就濕轉為例，對化學發(fā)光和ChemiDoc XRS的應用進行敘述。
一、轉膜（濕轉）：
（1）轉一張膜需準備2張6.5*10cm的濾紙和1張5.5*8.5cm的PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分鐘才可使用。
（2）在加有轉移液的搪瓷盤里放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、兩張濾紙和浸過的PVDF膜。
（3）打開夾子將黑的一面放入轉膜液中，從下往上依次放入海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿。
注意:1整個過程在轉膜液中進行在鋪每一層時要用刮子趕氣泡，尤其是膠與膜之間一定不能留有氣泡。
2撬玻璃板剝膠時動作要輕，用刮子將濃縮膠輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊
（4）將夾子合好，放到轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。接通電電轉移時會產熱，在槽的一邊有較大空隙，放入事先準備好的冰盒來降溫。將整個電泳槽放入一個大的容器中（大的塑料泡沫盒子最好），在這個容器中盛滿冰。
（5） 250毫安恒流轉膜2小時。
（6）2小時后，將膜取出，用TBST洗膜5分鐘。
（7）用5%脫脂奶粉室溫封閉。
封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質結合而不是和膜結合。
脫脂奶粉要用TBST配置，要在干凈的容器里進行封閉，且足以覆蓋住膜。
二、孵育一抗
一抗用BSA溶解，根據抗體說明書上的要求稀釋抗體（大部分稀釋度為1：1000），4℃過夜。 也可根據抗體量和膜上抗原量適當延長或縮短時間。
（有些一抗室溫孵育一小時也可得到滿意的結果）
三、孵育二抗
室溫孵育1小時。 一般采用HRP標記的二抗，稀釋比例為1:2000。
二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。
注意：孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗三次，每次五分鐘，時間一定要夠。
洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。
四、曝光
本實驗室選用威格拉斯 “western 發(fā)光檢測試劑盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學發(fā)光試劑盒（已針對CCD成像做了優(yōu)化），可獲得更好的效果。
（1）洗膜，2至3次，每次5分鐘
（2）在照膠儀放膜的平板上加少許水，取一張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上，排氣泡。
作用：a 保證PVDF膜能在一個相對干凈的平臺上曝光，避免污染。
b 鋪上保鮮膜后，背景顏色是純黑色且深淺均勻，這樣當半透明的PVDF膜在白測光下照Marker時，會更清晰、明顯。
（3）將膜放入照膠儀，調整明暗、大小、焦距，在目的條帶的marker出，用圓珠筆標一個印記。
（4）選擇EPI WHITE 光，點擊“White Epi IIIumination”點擊 Auto Expose 獲取marker圖片，圖片最大化，選中圖片，選擇file ->export to jpeg，quantity調至最大值100，保存至文件夾。保存為jpeg格式后，轉至其他電腦即使未安裝quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。
（5）將發(fā)光液A液和B液按1：1比例混勻、倒在PVDF膜上，發(fā)光液能蓋住膜即可，關閉WHITE EPI光（注意膜的位置從照Marker開始，不要改變）點擊“Chem Hi Sensitivity”，點擊“Live Acquire”選擇合適的曝光時間，張數，選擇指定文件夾，保存。
選擇比較滿意的圖片，按如上所說轉換至jpeg格式。
例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比較好曝的，可以調至10s一張，一般10張之內就可得到好的效果。其他不太容易出條帶的，可以適當延長時間。
對于內參來說，在曝第一張之前，讓發(fā)光液倒在膜上靜置反映20-30秒，有時會得到理想的效果。
（6）marker與目的條帶的比對：用 window自帶的“圖片和傳真查看器”軟件打開jpeg格式的marker圖片，用手在屏幕上點住剛剛用圓珠筆畫的印記，手不要松開，此時還用“圖片和傳真查看器”打開jpeg格式的目的條帶的圖片，手點的地方就是剛才marker的位置。
白測光下獲取的marker圖像
化學發(fā)光下目的蛋白條帶 蛋白上樣量：120μg 分離膠濃度：12%
白測光下獲取的marker圖像
化學發(fā)光下目的蛋白條帶 蛋白上樣量：80μg 分離膠濃度：12%
白測光下獲取的marker圖像
化學發(fā)光下目的蛋白條帶 蛋白上樣量：50μg 分離膠濃度：15%
結論：采用Bio-Rad的冷CCD化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行化學發(fā)光的檢測，比傳統(tǒng)的暗室曝光方法更為簡便，也大大縮短了實驗時間。但在成像時需要注意選擇合適的化學發(fā)光試劑，以適合CCD的成像檢測。且大部分的化學發(fā)光試劑均對應暗室曝光的方式，因此在進行檢測需要進行調整，如對發(fā)光液不能進行稀釋，而必須要使用原液。同時如果條帶的表達比較弱的情況下，如使用常用發(fā)光液可能需要更長的成像時間，當然更好的方法是選擇能快速產生強烈信號的化學發(fā)光試劑，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學發(fā)光試劑盒。
相關儀器及試劑訂貨信息
170-8251 Molecular Imager ChemiDocXRS+ System PC
170-8182 XciteBlue Conversion Screen and viewing goggles for SYBR Green/SYBR Safe/GFP/Flamingo Fluorescent Gel Stain
170-8184 Gel Alignment Templates
170-7950 White Light Transilluminator, universal hood
170-5070 Immun-Star WesternC Chemiluminescent Kit, includes 50 ml luminol/enhancer, 50 ml peroxide solution
161-0376 Precision Plus Protein WesternC Standards, 250 ul, 50 applications
WesternC 預染標準品效果圖及化學發(fā)光后成像效果圖
Bio-Rad Western blotting解決方案
