用葡聚糖（Dextran）和聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）二相不連續梯度分離純化動植物樣品的細胞膜片斷（特別是質膜）的方法始于1989年（文獻1）。這種方法的特點是快速，操作簡單，重復性好。只需要低速離心機（4,000rpm），分離成本低。

用PEG和Dextran 混合后再加入樣品，低速離心后形成上下二個液體相，體積相近。上液體相中對于動物細胞的亞細胞構造的排列，順序是（自下而上），內質網<線粒體<溶酶體<高爾基體<質膜；對于植物細胞其排列順序（自下而上）是：破碎的類囊體<完整的葉綠體<糙面內質網<線粒體，過氧化酶體<液泡膜<滑面內質網<類囊體<高爾基體<溶酶體<質膜。

 

常用的方法是：組織勻漿先以低速離心（甩平轉頭，500g，3min）去除沒有破碎的整細胞及其他組織碎片。上清液與Dextran 及PEG 混合后再低速離心（3,000xg，15min）形成二個液體相。

 

離心方案：

1. 原液制備：

   Dextran （20％w/w）：220克 Dextran T-500 (Pharmacia 產品) 溶于780克純水，電磁攪拌器加熱（40℃）并攪拌至全部溶解。

   PEG（3350，Union Carbide 公司出品，或相應產品）300克溶于1升水。

2. 制備液體二相：取200克，20％ Dextran ，103克PEG原液，33ml 0.2M Na3PO4 (PH6.5)和179ml 純水在量筒中充分混合，靜置過夜形成二相液體，PEG在上，Dextran 在下。可以看到明顯的分界面，中間有較窄的隔離帶。分別取出二液態相備用（Dextran下相包含隔離帶）

3. 用合適的方法將含有107--108 個細胞的動、植物組織制備成勻漿，用低速小型冷凍離心機水平轉頭（如Hitachi CF-RX 系列離心機，T5SS31 甩平轉頭或 CF-7D2 離心機T5SS 轉頭，最大容量 4×250ml 單管容量從5ml 到 250ml，用戶可按實際情況選用不同容量的離心管。也可以用其他品牌離心機和相應的轉頭）

4. 勻漿在500g （約1,600rpm）4℃離心3分鐘去除沒有裂解的細胞和組織（在沉淀中）

5. 第一次離心后的上清液在3,000xg （約4,100rpm）4℃ 離心15分鐘，保留沉淀。

6. 將第二次離心后的沉淀加入尚未形成二相的Dextran--PEG 混合液（第2步前段），充分混合。2,000xg（約3,300rpm）, 4℃離心10分鐘。離心后仍保持4℃。等待形成明顯的二個液態相（有隔離帶），亞細胞構造分布于二個液態相之中。

7. 分別收集（6） 離心后形成的二個含有亞細胞構造的液態相備用（上相和下相，下相包含隔離帶）

8. 根據容量選擇合適的離心管（常用50ml 帶蓋圓底管），第一類離心管下部是（2）中形成的Dextean液態相和隔離帶；上部是（7）中用水稀釋（3—5倍）的上相。上、下部體積比為6:4。

9. 第二類離心管下部是（7）中離心后的下相（包含隔離帶），上部是（2）中制備的PEG液態相，上、下部液體的比例為4:6

10. 以上二類離心管，分別用上下顛倒30—40次的方法充分混合后分別離心（3,000xg，約4,100rpm，4℃，10分鐘）

11. 第一類離心管離心后上部液態相中主要含質膜片斷，下部為其他亞細胞構造

12. 第二類離心管離心后上部及隔離帶中主要含質膜片斷，下部為其他亞細胞構造

 

討論：

1. 不同的組織，分離質膜的離心轉速和時間及PH值各有差異，可以從實驗中摸索，優化。

2. 離心后其他亞細胞構造可以用文獻中介紹的其他方法進一步分離純化（例如用Percoll，Nycodenz，metrizamide作自形成梯度分離）

 

參考文獻：

1. Fisher. D. and Sutherland, I.A.  “Separations using aqueous phase system”—Applicaion In cell biology and biotechnology . plenum press , New York .1989

2. W . Howard  Evans  “Isolation and characterization of membranes and cell organelles”, from “Centrifugation” Edited by David Rickwood，Oxford  Univ. press 1992

3. Presson  A. 等      Biochem . J .  vol:273  P173 (1991)

注：本文主要內容摘自文獻（2）