遺傳標記在遺傳學的建立和發展過程中有著舉足輕重的作用，隨著遺傳學的進一步發展和分子生物學的異軍突起，遺傳標記先后相應地經歷了形態標記、細胞學標記、生化標記和DNA分子標記四個發展階段。前三種標記都是以基因表達的結果為基礎的，是對基因的間接反映；而DNA分子標記則是DNA水平遺傳變異的直接反映，它具有能對各個發育時期的個體、各個組織、器官甚至細胞作出“中性”以及操作簡便等特點。正是這些特點，奠定了它極其廣泛的應用基礎。DNA分子標記本質上是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異特DNA片段^[1]。DNA分子標記大多以電泳譜帶的形式表現生物個體之間DNA差異，通常也稱為DNA的指紋圖譜。在過去10多年中，分子標記技術得到了突飛猛進的發展，至今已有幾十種分子標記技術相繼出現，并在基因庫構建、基因克隆、基因組作圖、基因定位、作物遺傳育種、植物親緣關系鑒別等各個研究領域得到了廣泛的應用。

 

    1980年Botesin提出的限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphisms ，RFLP)可以作為遺傳標記，開創了直接應用DNA多態性的新階段，是最早應用的分子標記技術^[2]。RFLP是檢測DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位點的分布情況，因此DNA序列上的微小變化，甚至1個核苷酸的變化，也能引起限制性內切酶切點的丟失或產生，導致酶切片段長度的變化。RFLP標記的等位基因具有共顯性的特點，結果穩定可靠，重復性好，特別適應于構建遺傳連鎖圖。但是，在進行RFLP分析時，需要該位點的DNA片段做探針，用放射性同位素及核酸雜交技術，既不安全又不易自動化。另外，RFLP對DNA多態性檢出的靈敏度不高，RFLP連鎖圖上還有很多大的空間區^[3]。

 

    為了克服RFLP技術上的缺點，Williams等^[4]于1990年建立了隨機擴增多態DNA(Randomamplified polymorphic DNA ，RAPD)技術，由于其獨特的檢測DNA多態性的方式使得RAPD技術很快滲透于基因研究的各個領域。RAPD是建立于PCR基礎之上的分子標記技術，基本原理是利用一個隨機引物(8～10個堿基)通過PCR反應非定點地擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分離擴增片段來進行DNA多態性研究^[5]。對任一特定引物而言，它在基因組DNA序列上有其特定的結合位點，一旦基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就可能導致這些特定結合位點的分布發生變化，從而導致擴增產物的數量和大小發生改變，表現出多態性。與RFLP相比，RAPD技術簡單，檢測速度快，DNA用量少，實驗設備簡單，不需DNA探針，設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析，不依賴于種屬特異性和基因組的結構，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析，用一個引物就可擴增出許多片段，而且不需要同位素，安全性好。當然，RAPD技術受許多因素影響，實驗的穩定性和重復性差^[6]，首先是顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對復雜^[7]，在基因定位、作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降;其次，RAPD對反應條件相當敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實驗的重復性差^[8]。

 

    擴增片段長度多態技術(AFLP)，又名限制片段選擇擴增技術(Selective restriction fragment amplifi2cation ，SRFA)，于1993年由荷蘭KEYGENE公司的Zabean和Vos等發明^[9]，并已申請專利。AFLP是近年來迅速發展起來的一種分子標記技術，它將基因組DNA用成對的限制性內切酶雙酶切后產生的片段用接頭(與酶切位點互補)連接起來，并通過5′端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量DNA片段，從而形成指紋圖譜的分子標記技術。AFLP指紋呈孟德爾式共顯性和顯隱性遺傳。它兼具RAPD與RFLP的優點，有較高的穩定性，用少量的選擇性引物能在較短時間內檢測到大量位點，并且每對引物所檢測到的多個位點都或多或少地隨機分布在多條染色體上，各染色體上AFLP標記的數目與染色體長度呈正相關(r =0.501)，而一對引物獲得的標記涉及的染色體數與標記數呈正相關(r =0.826)。因此，通過少量效率高的引物組合，可獲得覆蓋整個基因組的AFLP標記^[10]。目前，AFLP作為一種高效的指紋技術，已在遺傳育種研究中發揮它的優勢^[11]。不過也有研究認為，AFLP對基因組純度和反應條件要求較高^[12]，另外用于遺傳作圖時，少數的標記與圖譜緊密度有出入。此外，在RAPD和RFLP技術基礎上建立了SCAR(Sequence characterizedamplified regions ，序列特異性擴增區域)、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ，酶切擴增多態序列)和DAF(DNA amplified fingerprints ，DNA擴增指紋)等標記技術^[13]。這些技術的出現，進一步豐富、完善了第1代分子標記技術，增加了人們對DNA多態性的研究手段。

 

    在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復序列，如重復單位長度在15～65個核苷酸的小衛星DNA(Minisatellite DNA)，重復單位長度在2～6個核苷酸的微衛星DNA(Microsatellite DNA)。小衛星和微衛星DNA分布于整個基因組的不同位點。由于重復單位的大小和序列不同以及拷貝數不同，從而構成豐富的長度多態性。Moore等于1991年結合PCR技術創立了SSR(Simple sequence repeat，簡單重復序列)標記技術。SSR也稱微衛星DNA，是一類由幾個(多為1～5個)堿基組成的基序串聯重復而成的DNA序列，其中最常見的是雙核苷酸重復，即(CA)n和(TG)n ，每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單位數目10～60個，其高度多態性主要來源于串聯數目的不同。不同遺傳材料重復次數不同，導致了SSR 長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標記產生的基礎。SSR標記的基本原理是根據微衛星重復序列兩端的特定短序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段。由于核心序列重復數目不同，因而擴增出不同長度的PCR產物，這是檢測DNA多態性的一種有效方法。微衛星序列在群體中通常具有很高的多態性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標記。

 

2.2 ISSR 標記技術

    ISSR即內部簡單重復序列，是一種新興的分子標記技術。1994年Zietkiewicz等對SSR技術進行了發展，建立了加錨微衛星寡核苷(Anchored-microsatellite-oligonucleotides)技術^[14]。他們用加錨定的微衛星寡核苷酸作引物，即在SSR的5′端或3′端加上2～4個隨機選擇的核苷酸，這可引起特定位點退火，從而導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間的基因組節段進行PCR擴增。這類標記又被稱為ISSR(Inter simple sequence repeat)、ASSR(Anchored simple sequence repeats)^[15]或AMP PC^R[16]。在所用的兩翼引物中，可以一個是ASSR引物，另一個是隨機引物。如果一個是5′端加錨的ASSR引物，另一個是隨機引物，則被稱為RAMP技術^[17]。

 

    單核苷酸多態性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)被稱為第3代DNA分子標記，是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異，這種差異包括單個堿基的缺失或插入^[18]，更常見的是單個核苷酸的替換，且常發生在嘌呤堿基(A與G)和嘧啶堿基(C與T)之間。SNP標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異，被認為是應用前景最好的遺傳標記。目前，已有2000多個標記定位于人類染色體上，在擬南芥上也已發展出236個SNP標記。在這些SNP 標記中大約有30%包含限制性位點的多態性。檢測SNP的最佳方法是DNA芯片技術，最新報道的微芯片電泳(Microchip electrophoresis)，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP，它比毛細管電泳和板電泳的速度可分別提高10 和50倍^[19]。SNP與第1代的RFLP及第2代的SSR標記的不同有2個方面:其一，SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記;其二，SNP標記分析完全摒棄了經典的凝膠電泳，代之以最新的DNA芯片技術。

 

    表達序列標簽(Expressed sequence Tag ，EST)是美國國立衛生研(National Institutes of Health ，NIH)的生物學家Venter于1991年提出的^[20]。隨著人類基因組計劃的開展，EST技術首先被廣泛應用于尋找人類新基因，繪制人類基因組圖譜，識別基因組序列編碼區等研究領域，之后又被廣泛應用于植物基因組研究^[21]。EST是指在來源于不同組織的cDNA文庫中隨機挑選克隆、測序，得到部分cDNA序列，一個EST對應于某一種mRNA的cDNA克隆的一段序列，長度一般為150～500bp，只含有基因編碼區域。EST可代表生物體某種組織某一時間的一個表達基因，所以被稱之為“表達序列標鑒”;而EST的數目則顯示出其代表的基因表達的拷貝數，一個基因的表達次數越多，其相應的cDNA克隆越多，所以通過對cDNA克隆的測序分析可以了解基因的表達豐度^[22]。目前構建cDNA文庫一般都使用試劑盒，方法成熟，而且飛速發展的DNA測序技術，也使得進一步降低大規模DNA序列測定成本成為可能^[23]。

 

    RGAs是用基于抗病基因保守序列設計的引物擴增基因組得到的抗病基因類似序列的新型的分子標記。盡管基因間整個序列的同源性不足于用RFL P 雜交檢測，但抗病基因中存在的這些保守區域為在其它植物中進行PCR 擴增和分離RGAs 提供了機會^[24]。

 

    利用RAPD引物和微衛星上游或下游引物結合，對基因組DNA 進行擴增，探索更有效的揭示所有微衛星及其他DNA遺傳多態性的方法，以期獲得研究DNA多態性的新的分子標記方法。因該方法同時利用隨機引物和微衛星引物進行擴增，暫時定名為隨機微衛星擴增多態DN^A[25]。

 

    SRAP標記是基于PCR技術的新型分子標記技術，其原理是利用基因外顯子里G、C 含量豐富，而啟動子和內含子里A、T含量豐富的特點設計兩套引物，對開放閱讀框架進行擴增。此技術具有簡便、穩定、中等產率和容易得到選擇條帶序列的特點，在基因組中分布均勻，適合于不同作物的基因定位、基因克隆和遺傳圖譜構建^[26]。

 

    TRAP是由HUJ G等于2003年從SRAP技術改進而來的新型分子標記技術，其原理是借助大規模測序技術產生的龐大生物序列信息，利用生物信息學工具和表達序列標簽數據庫信息設計引物，對目標候選基因序列區進行PCR擴增產生多態性標記。此標記具有操作簡單、重復性好、穩定性好、效率高的特點。目前已經成功應用于許多植物的遺傳圖譜構建、重要性狀基因標記、種質資源的多樣性研究及分子標記輔助育種等方面^[26]。