雌二醇 (E2) ELISA試劑盒使用說明

（德國DRG：EIA2693）

1、前言說明

E2是一種含一個酚A環的18C類固醇激素。此類固醇激素的分子量為272.4，它是人體中最有效的雌激素，主要由女性卵巢的格拉芬卵泡和胎盤產生，少量由腎上腺和男性睪丸產生。E2（雌二醇）被分泌到血液中，在血液中有98%的雌二醇會結合到性激素結合蛋白上，有的還會結合到其它血清蛋白上（如血清白蛋白），只有很少一部分以游離形式存在。雌激素的活性會受到雌二醇受體符合物的影響，此符合物可在靶位并在核酸水平上引發相應的反應。這些靶位包括：卵泡、子宮、乳房、陰道、尿道、下丘腦、垂體和敏感稍低的肝臟與皮膚。在月經周期正常的未懷孕女性體內，雌二醇的分泌遵循著一種循環模式，在排卵前有兩個明顯的高峰期。高濃度的雌二醇可在垂體水平發揮正反饋作用，它會影響垂體促性腺激素的分泌,如卵泡刺激素和黃體生成素，前者是卵泡成熟所必要的，后者是排卵形成所必要的。排卵后，雌二醇水平迅速下降直到黃體細胞被激活，結果雌二醇水平出現第二次高峰，并在黃體階段達到一平衡述評。在懷孕期間，母體血清雌二醇的水平會極度的增加，并且會超過排卵前的峰值，而且在整個孕期維持在高水平上。血清雌二醇的檢測是評價各種月經功能障礙的一個有效指標，例如女性早熟和晚熟，原發性、續發性閉經和絕經癥。據報道，女性化綜合征、男子女性型乳房和睪丸癌患者的血清雌二醇水平會升高。在不孕患者體內，血清雌二醇的檢測有利于監測藥物治療（如克羅米酚檸檬酸鹽、促黃體生成素釋放激素或外源性促性腺激素）后排卵的感應情況。在因為體外受精而引起的卵巢過度刺激綜合征患者中，每天監測血清雌二醇濃度以便為hCG的管理和卵母細胞的采集提供最佳時間。

2、檢測原理:

   DRG公司的雌二醇酶免試劑盒是一種基于競爭法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應板上的微檢測孔包被有能結合雌二醇分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內源性雌二醇的病人樣本與辣根過氧酶標記的雌二醇競爭性的結合包被板上的抗體。溫育之后，未結合的酶聯物用洗滌液洗去。過氧酶與包被抗體的結合量與樣品中雌二醇的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強度與病人樣品中雌二醇的濃度成反比。

3、試劑盒成分:

1)       包被板，12×8（可拆），96孔，微孔中包被了抗雌二醇的兔單克隆抗體。

2)       標準品：7支1.0ml/支。分別含量為：0；25；100；250；500；1000；2000pg/ml。 (1pg/ml=3.67pmol/L)

3)       酶聯結物：1支，25 ml，內含辣根過氧化物酶標記的雌二醇。

4)       底物液：1支，內含，14ml ，內含TMB

5)       終止液：1支，0.5M的 H₂SO₄，14ml，避免接觸終止液，以免造成刺激皮膚和著燒皮膚。

6)       洗滌液(40×)，1支，30ml

注：用于樣品稀釋的零標準品視需要而定。

4、實驗需要器材（但試劑盒不提供）

1)        酶標儀(450±10nm)。

2)        微量移液器和吸嘴 25μl、100μl、200μl。

3)        坐標紙。

4)        去離子水。

5、試劑貯存:

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存時，其活性在有效期內穩定，不要使用過期試劑。所有開封了的試劑都必須儲存于2-8℃的環境下，微孔反應板也必須貯存于2—8℃的環境下。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來。

6、試劑準備

實驗開始前，將所有的試劑和所需數目的板條都平衡至室溫。

洗滌液：在30ml的濃縮洗滌液中加入1170ml去離子水進行稀釋，稀釋好的洗滌液室溫下可穩定存放2周。

7、樣本采集和準備

7.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，室溫下離心獲取血清。

血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。

7.2樣品的儲存

實驗開始前，應當將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環境下可穩定存放5天。如果實驗前想要將樣品存放更長的時間，則應將樣品凍存于-20℃的環境下。解凍的樣品在實驗前應反復倒置幾次。

7.3樣品的稀釋

在首次實驗時，如果血清樣品中睪酮的濃度高于最高標準品中睪酮的濃度，則應將此樣品用零標準品稀釋10或100倍，并按實驗步驟重新檢測。在計算濃度時應當將此稀釋因子考慮進去。

例如：

a）  按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標準品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標準品（充分混合）

8、實驗步驟:

所有的標準品、樣品和質控品都做雙份檢測以保證所有的檢測條件都相同。

1)       將所需數量的板條固定到板架上。

2)       將標準品、質控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應的微孔中。

3)       在每一微孔中加入200μL酶聯物。

4)       充分混勻10秒，在這個步驟完全混勻很重要。

5)       室溫孵育120分種。

6)       快速棄去孔內反應物，每孔用400μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和精確度。

7)       在每一微孔中加入100μl底物液。

8)       室溫孵育15分種。

9)        加50μl終止液到每個檢測孔中終止酶反應。

10)     加終止液后10分鐘之內，用酶標儀在450±10nm處測定OD 值。

9、結果計算:

1)       計算每個標準品、質控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)       用吸光度值作為縱坐標（y），濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應的濃度值進行標繪，作一標準曲線。

3)       用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應的濃度。

4)        自動計算方法：在IFU上，它用四參數曲線已自動計算出結果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結果。

5)        樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于最高標準品的必須用進行進一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應當把此稀釋因子考慮進去。

10、參考值

我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。在一明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的雌二醇ELISA試劑盒進行檢測得到如下結果：

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

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