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基孔肯雅IgM抗體ELISA檢測(cè)試劑盒主要用于定性檢測(cè)人血清和血漿中抗基孔肯雅病毒的IgM抗體。

此試劑盒基于ELISA技術(shù)。包被板中包被了抗人IgM抗體，如果人血清或血漿中含有IgM時(shí)，則會(huì)與其特異性結(jié)合，洗板將未結(jié)合的物質(zhì)洗去，然后加入基孔肯雅抗原溶液，洗板洗去未結(jié)合的物質(zhì)，然后加入鏈霉親和素和基孔肯雅抗體酶聯(lián)物。洗板后，加入TMB底物液，顏色變成藍(lán)色，加入終止液終止反應(yīng)，顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，最后用酶標(biāo)儀在450nm處讀數(shù)。

包被板：12×8可拆卸，包被了抗人IgM抗體，密封在可重封鋁箔袋中

基孔肯雅溶液1：1瓶包含6mL的基孔肯雅抗原溶液，即用，白蓋

基孔肯雅溶液2：1瓶包含6mL的生物素化的基孔肯雅抗體，即用，藍(lán)色，白蓋

基孔肯雅IgM陽(yáng)性質(zhì)控：1瓶，1.5mL，黃色，即用，紅蓋

基孔肯雅IgM臨界質(zhì)控：1瓶， 2mL，黃色，即用，綠蓋

基孔肯雅IgM陰性質(zhì)控：1瓶，1.5mL，黃色，即用，藍(lán)蓋

樣本稀釋液： 1瓶包含100mL的即用緩沖液，用于稀釋樣本，pH7.2±0.2，黃色，白蓋

洗滌液：1瓶，包含50mL  20倍濃縮的緩沖液，（pH7.2±0.2）用于洗板，白蓋

鏈霉親和素結(jié)合液：1瓶包含6mL過(guò)氧化物酶結(jié)合的鏈霉親和素，即用，紅色，黑蓋

TMB底物液：1瓶包含15mL  TMB，即用，黃蓋

終止液：1瓶包含15mL，即用，內(nèi)含硫酸，0.2mol/l，紅蓋

 

             固定板

             封板片

             酶標(biāo)儀（450/620nm）

             37℃孵箱

             洗瓶或自動(dòng)洗板機(jī)

             10~1000μL的移液器

             漩渦混勻器

             蒸餾水或去離子水

             一次性試管

             計(jì)時(shí)器

試劑在有效期內(nèi)，儲(chǔ)存于2-8℃穩(wěn)定

洗滌液的準(zhǔn)備

用雙蒸水稀釋洗滌液，例子：10ml洗滌液+190ml雙蒸水。稀釋好的洗滌液在室溫下5天內(nèi)有效。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的樣本是人血清和血漿，如果實(shí)驗(yàn)在樣本采集后的5天內(nèi)進(jìn)行，則需要儲(chǔ)存在2-8℃，否則，必須于-20℃到-70℃深度凍存。如果樣本是深度凍存的，在使用前，則需要充分混勻，避免反復(fù)凍融。

不推薦使用熱滅活的樣本

將10μL樣本跟1ml的樣本稀釋液混勻，并用漩渦混勻器充分混勻。

在開(kāi)始試驗(yàn)前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀試驗(yàn)說(shuō)明。結(jié)果的可信度是依賴(lài)于嚴(yán)格地按照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明來(lái)進(jìn)行的，鋪板時(shí)最少留1個(gè)孔為空白對(duì)照（A1）1個(gè)陰性質(zhì)控孔（B1）2個(gè)臨界質(zhì)控孔（C1+D1）1個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控孔（E1）。開(kāi)始試驗(yàn)前，請(qǐng)將所有試劑都平衡到室溫

1.         吸取50μL的質(zhì)控品和稀釋過(guò)的樣本到相應(yīng)的孔中，留A1孔做空白對(duì)照孔

2.         封板

3.         在37±1℃下孵育1小時(shí)±5分鐘

4.         當(dāng)孵育完成時(shí)，揭去封板片，棄去反應(yīng)液，每孔300μL洗滌液，洗板3次，避免溢出。每孔浸泡的時(shí)間都必須＞5秒，最后拍板將殘留的液滴都拍去。

5.         吸取50μL基孔肯雅溶液1到除了空白對(duì)照孔的每個(gè)孔中，蓋板

6.         在室溫孵育30分鐘

7.         重復(fù)步驟4

8.         將基孔肯雅溶液2跟鏈霉親和素結(jié)合物混勻10分鐘

9.         吸取50μL基孔肯雅溶液2跟鏈霉親和素的復(fù)合物到除了空白對(duì)照孔的每個(gè)孔中，蓋板。

10.     室溫孵育30分鐘

11.     重復(fù)步驟4

12.     吸取100μL  TMB底物液到每個(gè)孔中

13.     避光孵育15分鐘（精確）

14.     加入100μL終止液到每個(gè)孔中，與加TMB底物液時(shí)的間隔和順序都必須一樣

15.     用酶標(biāo)儀在加入終止液后30分鐘內(nèi)與450/620nm處檢測(cè)

調(diào)整酶標(biāo)儀，以空白對(duì)照孔調(diào)零，以450nm處檢測(cè)所有孔的吸光度值。

只有以下條件符合，檢測(cè)的結(jié)果才能認(rèn)為的有效的

  空白對(duì)照孔             吸光度值＜0.100

  陰性質(zhì)控孔             吸光度值＜臨界質(zhì)控

  臨界質(zhì)控孔             吸光度值0.150-1.300

  陽(yáng)性質(zhì)控孔             吸光度值＞臨界質(zhì)控

如果以上條件不符合的，那么試驗(yàn)結(jié)果則是無(wú)效的，需要重新檢測(cè)

臨界質(zhì)控平均吸光度值的計(jì)算，例子：吸光度1：0.39；吸光度2：0.37

                                  （0.39+0.37）/2=0.38

                                 平均吸光度值為0.38

樣本如果是比臨界值高出10%，則認(rèn)定為陽(yáng)性，

樣本如果是在臨界值上下10%之內(nèi)，則認(rèn)定為灰色區(qū)（推薦在2-4周之后再次檢測(cè)新鮮的樣本，如果樣本仍然是灰色區(qū)，可以直接認(rèn)為是陰性）

樣本如果是比臨界值低出10%，則認(rèn)定為陰性

病人樣本平均吸光度值×10     = U

   臨界值

 

 

例子： 1.216×10    =32U

0.38

臨界值： 10   U

灰色區(qū)：9-11   U

陰性：   ＜9   U

陽(yáng)性：   ＞11  U

 

 

 

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