賈偉

沃特世科技（上海）有限公司實驗中心

 

液質數據中，不但含有蛋白藥序列表達是否正確的肽圖信息，其它雜質蛋白同樣可以被挖掘出來。然而，單純的雜質蛋白鑒定卻又是不夠遠遠的，其確切的含量信息同樣至關重要。沃特世PLGS軟件可以在肽圖液質數據中，進一步鑒定其中的雜質蛋白，并其相對含量信息進行分析。

 

使用相應的開放數據庫，PLGS軟件首先根據液質數據中的離子碎片信息對多肽進行鑒定，進而組裝出樣品中的所有蛋白，完成蛋白鑒定步驟。在蛋白相對含量測定中，PLGS軟件充分利用了MS^E全信息串聯質譜方法的數據優點。較DDA方法，MS^E數據的離子色譜峰近乎“完美”，更加符合實際多肽色譜峰型。通過全面研究發現，MS^E數據中的多肽色譜峰強度信息，與蛋白濃度相關性非常好。使用每個蛋白鑒定多肽中，強度前三的多肽峰強度加和值，即表征其蛋白濃度。因此，使用PLGS分析同一個肽圖液質數據，便可“順便”完成雜質蛋白的鑒定與相對定量工作。

 

如果想得到樣品中準確的蛋白絕對濃度信息，也非常簡單。只需在樣品中加入一個已知的蛋白內標便可。這時Hi3分析方法會根據內標蛋白的濃度，按照以下公式，對樣品中的絕對濃度進行定量[1,2]。

 

 

融合抗體anti-phosphotyrosine IgG 1 (PTG1 mAb)使用中國倉鼠卵巢細胞系DG-44 CHO在兩種培養條件下表達，表達后的PTG1 mAb再分別使用A、B兩種方法純化。經過2D-UPLC MSE方法采集液質數據后，使用PLGS軟件分析[3]。在分析結果中，可以明確地給出鑒定到樣品中含有的雜質蛋白，以及給出這些雜質蛋白的相對含量結果（圖1）。為了驗證Hi3定量方法的可靠性，使用MRM方法對以上實驗結果中Clusterin、Elongation factor 1-alpha、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase三個蛋白進行了定量驗證。通過Hi3與MRM兩種定量方法結果對比，可以發現兩者定量濃度非常接近（圖2）。在使用PLGS進行樣品中的雜質蛋白鑒定與定量分析中，檢索方法設置與肽圖分析幾乎一致，只增加將參考蛋白的名稱與濃度列入分析參數一步。之后，所有的分析過程都將由PLGS自行完成，并直接給出蛋白鑒定身份與濃度的結果列表。實際上PLGS不僅使用在生物藥雜質蛋白分析中，在樣品極為復雜的蛋白質組學研究中，Hi3

方法已經被長期使用，并有眾多高水平論文發表[4,5,6]。

圖1. 雜質蛋白鑒定結果及其含量。

 

參考文獻

(1) Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP, Geromanos SJ.Absolute Quantification of Proteins by LCMS. Mol Cell Proteomics.2006, 5, 144-156

(2) Silva JC, Denny R, Dorsc hel C, Gorenstein MV, Li GZ,Richardson K, Wall D, Geromanos SJ. Simultaneous Qualitative and Quantitative Analysis of the Esc heric hia coli Proteome. Mol Cell Proteomics. 2006, 5, 589-607.

(3) Catalin Doneanu, Keit h Fadgen, St Jo hn Skilton, Mart ha Sta pel s, Weibin C hen. A generic 2D-UP LC/MS assay for the identification and quantification of host cell proteins in biopharmaceuticals. Waters application note 2011, 720004043en

(4) Tenzer S, Wee E, Burgevin A, Stewart-Jones G, Friis L, Lamberth K, Chang CH, Harndahl M, Weimershaus M, Gerstoft J, Akkad N, Klenerman P, Fugger L, Jones EY, McMichael AJ, Buus S, Schild H, van Endert P, Iversen AK. Antigen processing influences HIV-specific cytotoxic T lymphocyte immunodominance. Nat Immunol. 2009, 10,

636-646

(5) Stapels M, Piper C, Yang T, Li M, Stowell C, Xiong ZG, Saugstad J, Simon RP, Geromanos S, Langridge J, Lan JQ, Zhou A. Polycomb

group proteins as epigenetic mediators of neuroprotection in ischemic tolerance. Sci Signal. 2010, 3, 111, ra15

(6) Wang X, Kota U, He K, Blackburn K, Li J, Goshe MB, Huber SC, Clouse SD. Sequential transphosphorylation of the BRI1/BAK1 receptor

kinase complex impacts early events in brassinosteroid signaling. Dev Cell. 2008, 15, 220-35.