【摘要】　目的　探討心理應激對工作記憶(workingmemory)的影響及中樞遞質多巴胺(dopamine,DA)的前體酪氨酸(tyrosine)的干預作用。方法　先用八臂放射狀迷宮訓練大鼠(1次/d、6d/周、連續10周)至學習記憶形成,再以CommunicationBox模型對大鼠進行連續14d、30min/d的心理應激,并從0d起經飼料給予250,500和1000mg/kg3個劑量的酪氨酸干預,觀察第1,4, 7, 10, 13天的工作記憶錯誤(workingmemoryerror)及參考記憶錯誤(referencememoryerror)。結果　與對照組相比,心理應激組在第1,7,10,13天的工作記憶錯誤及所有時間測定的參考記憶錯誤皆高于對照組。與心理應激組相比,酪氨酸1000mg/kg組在第7天及第13天出現工作記憶錯誤降低,在第4天及第10天出現參考記憶錯誤降低,酪氨酸500mg/kg組在第10天時也出現了工作記憶錯誤、參考記憶錯誤的降低,酪氨酸250mg/kg組均未出現具有顯著性統計學意義的變化。結論　急性和反復的心理應激能夠損害大鼠的工作

記憶,高劑量酪氨酸能在較早期降低心理應激對工作記憶的損害, 500mg/kg酪氨酸干預對降低較長期的心理應激造成的工作記憶損害也有一定的作用。

【關鍵詞】　心理應激; 　工作記憶; 　酪氨酸

　1974年,Baddeley等在分析短時記憶的基礎 上首次提出了工作記憶(workingmemory)是一種對信息進行暫時性的加工和儲存的能量有限的記憶系統這一概念。在隨后多年的研究中發現,工作記憶對于語言理解、學習、推理、思維等復雜認知任務的完成起關鍵作用。目前,多數研究者認為前額(正中)皮層(mesoprefrontal cortex, mPFC)參與工作記憶的執行加工過程,控制并協調工作記憶的信息加工過程。mPFC區主要由中腦腹側被蓋區(ventraltegmental area,VTA)的多巴胺(dopamine, DA)神經元投射,極易被心理應激所激動,導致DA耗竭,對

工作記憶產生損害。本文的目的是探討心理應激對工作記憶的作用以及中樞遞質DA的前體物質酪氨酸(tyrosine)干預的影響。

材料與方法

一、材料

1. 動物:純種Sprague2Dawley (SD) 雄性大鼠40只,體重180～220g,海軍醫學研究所實驗動物中心提供。

2. 器材:八臂迷宮:光滑塑料板制成,置于距地面75cm高,中心平臺直徑51. 5cm,八臂的每臂

長60cm,寬11cm,臂側板高10cm,透明。每臂距遠端3cm處,設1cm深、直徑2cm的餌食坑; Com2municationBox心理應激模型。

3. 試劑:酪氨酸,相對分子量181. 19,由上海聯合食品添加劑公司提供,純度>98. 0%。

二、方法

1. 動物處理:單一籠飼養于隔音室,光/暗周期為12h/12 h(倒轉實驗鼠晝夜節律,光照時間為

18∶00～06∶00, 06∶00～18∶00為暗周期,使用40W白熾燈照明,使迷宮訓練及測定在暗周期進行)。溫度為(23±2)℃。實驗前自由進食普通飼料,適應1周。限制進食量,控制動物體重使下降到約85%并維持,然后開始進行迷宮訓練及實驗。在訓練及實驗期間,每天于18∶00(訓練和測試完成后)喂食,以保證第2天訓練和測試時處于食物剝奪狀態。2. 迷宮訓練:開始3d,大鼠放在迷宮中央平臺,允許自由探尋和吃散在迷宮的餌食以適應。(餌食配方為:奶粉6mg,乳糖23mg,低取代羥基纖維素2. 5mg,硬脂酸鎂0. 5mg,滑石粉1mg,糖粉17mg。經制粒后,壓片機壓成50mg/片)。以后,每只大鼠每天訓練1次,每周訓練6d。訓練時,只用4臂做食物臂,保持同只大鼠喂食的方式直到實驗結束,但每個大鼠4個方向不同以減少氣味的線索。每只大鼠訓練完用酒精擦去其排泄物。大鼠吃完4個食物臂或做過14次選擇,或者到了10min,

即結束1次訓練。當大鼠4次連續訓練最多只有1次錯誤時,就視作達到工作記憶形成的標準。這時

它每周訓練2次,待所有大鼠都達標準,即作為工作記憶形成動物進行心理應激實驗。訓練和試驗時記錄兩種錯誤(統計累積次數):進入一個已吃過食物的臂為工作記憶錯誤(working

memoryerror),進入無食物臂為參考記憶錯誤(ref2erencememoryerror)。

3. 心理應激:采用CommunicationBox心理應激模型,被電擊的大鼠(電擊電流為1～2mA,周期

100s,間歇90s)驚叫、驚跳,實驗大鼠不受電擊,而是旁觀其它大鼠遭受電擊的過程,通過視覺、聽覺等產生心理應激。

4. 實驗分組: 40只工作記憶形成大鼠,按體重編序,遵循組間均衡的原則分為5組,分別為:空白對照組(不給予心理應激,喂食普通飼料100g/kg體重)、心理應激組(給予心理應激,喂食普通飼料100g/kg體重)、酪氨酸干預組(給予心理應激,并從應激暴露前一天即0d開始給予酪氨酸低、中、高3個劑量,即酪氨酸250, 500和1000mg/kg3個亞組,將酪氨酸混入普通飼料予以100 g/kg體重喂食)。普通飼料中酪氨酸含量測定根據GB/T18246- 2000(飼料中氨基酸的測定)規定的方法,用Hita2chi835- 50型氨基酸自動分析儀測定,酪氨酸含量

為0. 53%(5. 3mg/g)。

5. 實驗過程:每次心理應激在08∶00～10∶00進行, 30min/ (組·次), 1次/d,連續14d。對照組為放入應激裝置內不給予電刺激,以保持實驗條件完全一致。各組分別在第1, 4, 7, 10, 13天應激結束后即刻測定工作記憶錯誤和參考記憶錯誤。

6. 數據統計:數據表示采用�x±s� x,統計分析用ANOVA法。

結 果

1. 迷宮訓練:大鼠八臂迷宮訓練的工作記憶錯誤、參考記憶錯誤見圖1。從第1周工作記憶錯誤(1. 43±0. 28, n=40)、參考記憶錯誤(4. 33±0. 63,n=40)至第10周工作記憶錯誤(0. 05±0. 02, n=40)、參考記憶錯誤(0. 12±0. 04, n=40)達到一個相對穩定的規定水平,可以視為工作記憶形成。

2. 心理應激對工作記憶作用:結果如表1、2所示,與對照組相比,心理應激組在第1, 7, 10, 13天的工作記憶錯誤有明顯升高,所有時間測定的參考記憶錯誤皆高于對照組,說明心理應激損害大鼠的空間工作記憶能力。

　　3. 酪氨酸干預對心理應激影響:同表1, 2所見,與心理應激組相比, 1000mg/kg及500mg/kg各組大鼠在不同應激天酪氨酸干預組均出現不同程度的工作記憶錯誤、參考記憶錯誤的降低。1000mg/kg組在第7天及第13天出現明顯的工作記憶錯誤降低,在第4天

及第10天出現明顯的參考記憶錯誤降低。酪氨酸500mg/kg組在第10天時工作記憶錯誤、參考記憶錯誤的降低也具有顯著性統計學意義。酪氨酸250mg/kg組未出現具有顯著性統計學意義的變化。由此提示: 高劑量酪氨酸能夠較早的降低心理應激對工作記憶的損害, 500mg/kg的酪氨酸對降低較長期的心理應激造成的工作記憶損害也有一定的作用。

討 論

1. 本實驗的工作記憶動物模型:在人類,目前心理行為學、神經心理學以及神經影像學在關于工作記憶的研究方面已積累了大量證據,發現至少存在兩種類型的工作記憶系統,即詞語工作記憶(ver2balworkingmemory)和空間工作記憶(spatial work2ingmemory),而動物工作記憶模型的建立則主要依靠空間工作記憶。Smith等認為空間工作記憶包括信息的儲存和復述兩個方面,由不同的腦區控制。空間復述包含對空間位置的選擇性注意,本實驗采用的八臂放射狀迷宮利用整體空間環境,考察動物對空間的選擇性注意和復述能力,工作記憶錯誤、參考記憶錯誤能比較準確地反映動物的搜尋能力及復述能力,是一個比較理想的空間工作記憶動物模型。Woodsom等最近指出,放射狀迷宮仍然是研究學習記憶的最佳的動物模型之一。

2. 本實驗的心理性應激源:在過去的大多數心理應激動物實驗是依靠束縛、電擊、寒冷、疲勞等手段來進行,存在著太多的軀體物理性刺激。目前來看,模擬較為純粹的心理性應激方法有兩種,一種是通過相等的物理量刺激,比較不同的先后刺激次序來研究心理性應激的作用;另一種是本實驗的Com2municationBox模型,采用實驗鼠旁觀電擊鼠驚恐、跳躍、尖叫,通過視覺、聽覺產生心理應激,從很大程度上避免了對動物的軀體性刺激,可以認為是較為

純粹的心理性應激。

3. 本實驗觀察到心理應激損害工作記憶(表1, 2),其機制可能是mPFC參與控制并協調工作記憶的信息加工過程。用靈長類或嚙齒類動物模型研究發現,工作記憶缺陷產生于mPFC的損壞或去除,這個記憶缺陷也能由mPFC中DA的耗竭或DA受體的阻斷而重現。這些研究表明mPFC的DA系統是工作記憶過程的關鍵,這個高級皮層功能依賴于mPFC。這一系統對幾乎所有的應激均表現為活性增強,其DA的代謝和DA釋放具有“優先活性”,即使不足以引起中樞去甲腎上腺素(NE)改變的極輕度應激,如低強度的足底電擊,輕度的噪聲刺激

,也可引起前額皮質DA的釋放增多。這是由于mPFC的DA神經元與其它腦區的DA神經元比較,缺少突觸前D2 受體。這一特點使只有前額皮質DA神經元才不受D2 自身受體的控制與調節,進而在即使非常輕度的應激狀態下也可以迅速釋放DA發揮效應,從而引起DA的耗竭。另外,由于mPFC的DA神經元來自VTA的投射,應激時VTA其他神經元遞質的變化也可能對mPFC的功能產生影響。Kalivas等指出VTA的某些傳入途徑已經顯示了在應激誘導中介的mPFCDA系統中的作用,許多神經遞質在VTA的傳入中能夠影響mPFCDA細胞的功能,包括52HT、NE、Ach、GABA、鴉片肽、興奮性氨基酸(如:谷氨酰胺)以及神經肽(如: P物質)等。在這些方面需要進行更加深入的探索和研究。

4. 酪氨酸干預作用:酪氨酸是中性芳香族氨基酸,飲食中能供給,也能由苯丙氨酸轉化而來。美軍研究表明150mg/kg酪氨酸口服能提高戰士應激時的清晰思考能力,充足酪氨酸攝入能提高大腦的智力分析能力。本實驗采用250, 500, 1000mg/kg3個劑量進行干預,相當于本實驗飼料中所給予的酪氨酸量的0. 5, 1和2倍。結果證明酪氨酸干預對應激時工作記憶的損害有保護作用,雖然給予1000mg/kg酪氨酸不能馬上降低應激對工作記憶的損害,但能在接受應激的較早期(第4天)降低應激對工作記憶的損害程度。500mg/kg酪氨酸干預也具有降低較長期的心理應激導致的工作記憶損害的作用。Lieberman等指出,海軍人員的特殊工作性質決定了其面臨著睡眠缺失及其他多種應激因素,容易導致操作效率的下降。對于具有復雜應激因素

的作業如航海作業,酪氨酸有可能提高作業人員的工作效率,減少操作失誤,因此有著良好的應用前景。以后的工作重點應該在于進一步的人群干預研究,以期獲取更多的證據。