感受態制備：農桿菌感受態細胞制備實驗
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農桿菌感受態細胞制備實驗
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農桿菌感受態細胞制備可以：（1）用于建立農桿菌轉化體系；（2）用于農桿菌表達系統構建；（3）用于農桿菌其他分子生物學研究。
實驗方法
- 氯化鈣法
- 電轉農桿菌感受態
| 實驗方法原理 | 在基因工程操作中，感受態細胞的制備和質粒的轉化是一項基本技術。感受態是細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態。農桿菌的感受態可用CaCl2處理而誘導產生。將正在生長的農桿菌細胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會使細菌細胞膜的透性發生改變，此時的細胞呈現出感受態。制備好的農桿菌感受態細胞迅速冷凍于-70℃可保存相當一段時間而不會對其轉化效率有太大的影響。 |
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| 實驗材料 |
土壤農桿菌LBA4404菌株 |
| 試劑、試劑盒 |
YEB液體培養基 酵母提取物 牛肉膏 蛋白胨 蔗糖 硫酸鎂 氯化鈣 利福平儲液 |
| 儀器、耗材 |
超凈工作臺 恒溫搖床 冷凍高速離心機 高壓滅菌鍋 冰箱 超低溫冰柜 分光光度計 接種針 試管 離心管 離心管 冰浴 微量進樣器 吸頭 |
| 實驗步驟 |
一、實驗儀器、材料和試劑
1. 儀器
超凈工作臺，恒溫搖床，冷凍高速離心機，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進樣器及吸頭。 以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。
2. 材料
土壤農桿菌LBA4404菌株或其它農桿菌菌株 3. 試劑
（1）YEB液體培養基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。 （2）利福平（Rif）儲液：50 mg/ml
（3）20 mM CaCl2，高壓滅菌。
二、實驗步驟
1. 挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養過夜。
2. 取過夜培養菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養基中，28℃振蕩培養至OD600為0.5。
3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。
4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使農桿菌細胞充分懸浮，冰浴30 min。
5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預冷的20 mM CaCl2，充分懸浮細胞，冰浴中保存，24 hr內使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存備用。
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