細胞技術專題：細胞原代培養實驗
實驗方法
- 胰酶消化法
- 組織塊直接培養法
| 實驗方法原理 | 將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。最常用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
胎鼠 新生鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
1640培養基 牛血清 胰酶 Hank’s液 碘酒 |
| 儀器、耗材 |
培養箱 培養瓶 青霉素瓶 小玻璃漏斗 平皿 吸管 移液管 紗布 手術器械 血球計數板 離心機 水浴箱 |
| 實驗步驟 |
一、實驗材料準備
1. Hank’s液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。 二、具體操作 1. 將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。 2. 用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
3. 用手術剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank’s液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。
4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
5. 加入3-5 ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
6. 靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7. 1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。
8. 加入Hank’s液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
9. 加入培養液1-2 ml（視細胞量），血球計數板計數。
10. 將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25 ml細胞培養瓶中，37℃下培養。
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| 注意事項 |
1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
2. 在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。 4. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用 |
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