電轉化儀高效轉染mRNA進入小鼠受精卵形成穩定突變體

瀏覽次數：5925　發布日期：2015-7-29　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

摘要

隨著小鼠基因組序列測序完成，許多研究都圍繞著功能基因參與的生物學過程，特別是發育和疾病研究領域。那么穩定遺傳修飾的模型動物對于闡明基因的作用十分重要，然而，傳統的方法，包括在胚胎干細胞中的同源重組或是構建小鼠嵌合體，既耗時又耗力。然而新的基因組編輯方法明顯的優化這個過程。在有效的基因組編輯方法中CRISPR/Cas 9系統是構建攜帶修飾基因組最簡單的方法。

雖然，CRISPR/Cas9系統簡化了形成突變體的過程，但是將DNAs/RNAs微注射入受精卵需要特殊的技術，得到大量的突變體也十分耗時間（注射數以百計的受精卵）。那么，為了簡化這個過程，我們嘗試用電轉化儀將RNA導入受精卵。

電轉也被用于過小鼠受精卵，但是過程涉及去除卵透明帶，或是用酸臺氏液薄化處理，這些對細胞是非常有毒性的，而且只有短小的RNAs（短于1kb）可以被導入。

近期，一只大鼠突變體成功構建，借助于在保持卵透明帶完好的前提下轉染Cas9mRNA和gRNA入大鼠受精卵。然而基因組編輯的效率很低（低于9%），而且需要大量的Cas9（1000-2000ng/ul）。

方法與結果

為了優化電轉條件，我們使用BEX CUY21 EDIT II電轉化儀，以及鉑金塊電極，1mm間隔（圖1abc）。放在體視顯微鏡下，并連接電轉化儀。每次加入5ulRNA，可以電轉40-50個胚胎。

為了提高基因組編輯效率，分別借助mCherry mRNA和無肢基因Fgf10，優化參數，得到電轉受精卵存活并發育成兩細胞階段的比率是94-95%，比微注射方法34-35%要高很多。

當我們使用400ng/ul的Cas9 mRNA和200ng/ul gRNA進行轉染，87%的胚胎表現出缺失前、后腿，是圖2c（type I）；10%的突變體是肢體殘缺（type II）;只有3%的胚胎表現為正常（type III）。對I型突變體進行測序，發現Fgf10基因等位基因全部被打斷。

隨后，我們檢測了不同濃度的Cas9mRNA和gRNA對于基因編輯的效率。200ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，73%的胚胎無肢；100ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，32%展示肢體殘缺（圖2bc)；50ng/ul Cas9 mRNA 和25ng/ul的gRNA，胚胎大多正常。

Figure 1. Optimal conditions for the electroporation used to deliver mRNA into fertilized eggs.(a) Electroporation set-up used in this study. The right box is the electroporator CUY21 EDIT II (BEX Co.Ltd),which generates electric pulsed, and the left is a stereoscopic microscope for embryo manipulation. Two electrodes were placed on the microscope stage and connected to the electroporator.

Figure 2. CRISPR/Cas9mediated genome editing by electroporation. (b)Examples of embryos from the three classes that exhibited different limb phenotypes: no limbs (type I), limb defects (type II, left hind limb deficiency, right: truncated fore-and hind-limb) , and normal (type III).(c)Graph summarizing the effects of Cas9 and gRNA electro-poration on limb development. The concentrations of RNAs used in each experiment are shown at left. The numbers in each column are the number of embryos exhibiting the phe-notype in each category.

Figure 3. The single-stranded oligodeoxynucleotide(ssODN)-induced generation of HDR-mediated instertions.(b) Representative embryo electroporated with Cas9 mRNA, gRNA, and ssODN.The mCherry florescene completely disappeared in the electroporated embryos, while control (no electroporation) embryos displayed florescent signals.

為了確定基因組編輯的高效，轉染mCherry入11只小鼠中，發現所有11個小鼠都沒有紅色熒光（圖3b）。這一結果說明電轉染的方法還可以用于高效產生HDR介導的基因敲除小鼠。