聚合物和多糖的物理性質及行為極大程度上取決于其分子本身的性質。分子量和分子量分布、分子大小和結構都會影響物質的行為特性。凝膠滲透色譜(GPC)，又稱為尺寸排阻色譜(SEC)，是用來評估這些參數最常用的工具。

GPC的工作原理涉及在樣品流經多孔的惰性色譜柱基質時對樣品進行分離。較小的分子進入填料孔內，而較大的分子則被排除在外，因此可更快速地通過色譜柱。結果是得到一個基于流體力學體積的分離，而我們想要知道的是樣品的分子量。以前，分子量是通過對比樣品洗脫時間與已知分子量標準品洗脫時間進行估算。而現在，光散射檢測器是在不依賴保留時間的情況下對聚合物分子量進行測量的常用工具。使用多角度光散射(MALS)和特性粘度進行的Rg并行測量提供了對合成和天然聚合物分子結構及其分子量的優異檢測結果。

Viscotek SEC-MALS 20（圖1）是一種有20個角度的光散射檢測器，可以測量分子量和Rg（回轉半徑）。該檢測器可用作多角度檢測器GPC系統的一部分，與光散射及其他檢測器如示差折光(RI)、紫外光(UV)和特性粘度(IV)結合使用，以同時生成大量的樣品信息。

此應用說明中，將采用 Viscotek SEC-MALS 20 測得的分子量數據與Rg和IV測量值相結合，用于研究不同多糖的分子結構，包括支鏈淀粉、葡聚糖、羥丙基纖維素(HPC)、果膠和阿拉伯膠。此外，還對構象圖與Mark-Houwink圖之間的差異進行了研究。

圖1：Viscotek SEC-MALS 20系統

材料和方法
將SEC-MALS 20檢測器連接至Viscotek GPCmax和 Viscotek TDA系統。通過使用2根Viscotek A6000M色譜柱（葡聚糖、果膠和阿拉伯膠）或1根色譜柱（支鏈淀粉、羥丙基纖維素）分離樣品。流動相是磷酸鹽緩沖液。SEC-MALS 20 系統經 19kDa PEO 標準樣進行校正。檢測器和色譜柱均維持在35°C，以確保良好的分離并使基線穩定性最大化。

所有樣品均以 0.5至3 mg/ml的濃度溶解于流動相中，并以100µl體積進行進樣。葡聚糖樣品的分子量已知，可用于檢查校正結果。所有樣品均需溶解一整夜，以確保完全溶解。

結果

所有樣品均在系統內成功分離。顯示了果膠、阿拉伯膠和葡聚糖（圖 2A）及支鏈淀粉和 HPC（圖 2B）的 RI疊加色譜圖。

圖 2A：果膠、葡聚糖和阿拉伯膠的RI疊加色譜圖

 圖 2B： 支鏈淀粉和 HPC 的 RI 疊加色譜圖。

作為一個更詳細的示例，圖 3A 展示了果膠的色譜圖，顯示了 RI、LS (90°)和IV檢測器的結果。圖3B顯示了SEC-MALS 20檢測器的角度數據。從不同的角度可看出輕微的角度依賴性，允許對該樣品的Rg進行測量。圖3C顯示RI峰值與所測得的分子量、Rg、IV 和 Rh 重疊。

圖3：A.顯示果膠RI（紅色）、LS (90°)（橙色）和 IV（藍色）檢測器響應的色譜圖。B.顯示 MALS 數據的曲線。C. 顯示與所測得的 Rg（栗色）、分子量（黑色）、IV（藍綠色）和 Rh（青色）重疊的 RI 峰值衍生數據。

    表1總結了不同樣品的結果。研究中進行了重復進樣，每次進樣之間的所有測量值表現出極佳的可重復性。

雖然研究數值結果是比對樣品的一個不錯的定量方法，然而將數據繪制在MarkHouwink圖和構象圖上，從視覺角度來看也是一個快速比對樣品的理想方式。MarkHouwink圖顯示了作為分子量函數的特性粘度，而構象圖則顯示了作為分子量函數的Rg 值。因此，二者均可作為觀察分子大小隨著分子量的增加而增大的一個方式。均可在不同樣品之間進行即時比對，同時也非常適合于研究支化和其他結構變化。而在本例中，我們只重點關注不同的多糖在曲線上的分布情況。

表 1：測得的不同多糖樣品的分子量分布、IV、Rh 和 Rg 值。   

圖 4A：多糖的 Mark-Houwink 疊加圖。

圖 4B：多糖的構象疊加圖。 實線表示實際數據，虛線表示外推數據。

討論

在對 Mark-Houwink 和構象圖進行研究時，結果中所包含的信息隨即變得清晰起來。阿拉伯膠是樣品中分子量最高的，然而，它在兩個圖中的曲線卻是“最低的”：在質量上，它是所研究分子中最小的（構象圖）或是密度最大的（Mark-Houwink 圖）。雖然阿拉伯膠主要是多糖，但通常也含有蛋白質成分，這使其在僅增加了較小分子大小的同時增加了分子質量，所以上述結果也是意料之中的。

另一方面，果膠在兩個圖中的曲線都是最長的，這表明它是所研究分子中分散性最大的分子。這與其在色譜圖中擁有最寬的峰是一致的。這一點在 Mark-Houwink 圖上比在構象圖上體現得更清楚。由于顯示了Rg，構象圖僅針對半徑約在10nm的分子，該半徑的樣品光散射是各向異性的。 果膠分布圖中包含了一些低于該半徑限值的物質，無法測量其Rg。IV不受分子大小的限制，因此可在整個分子量分布中進行測量。作為兩個圖中“最高的”分子，果膠將其自身標識為所研究分子中最大（構象圖）且密度最小（Mark-Houwink 圖）的分子。

HPC、支鏈淀粉和葡聚糖分布于果膠和阿拉伯膠樣品之間，表明其結構介于這兩個極端值之間。

雖然這兩個圖給出的信息類似，但值得注意的是，其各自的優缺點使其適用的應用各不相同。如上所述，構象圖不可用于較小的分子。然而，作為分子大小的直接測量方法，它并不依賴于任何形狀模型。如需將 IV 轉換為大小值，必須假定一些形狀模型，如表1中的Rh計算。
總之，在此應用說明中，所選多糖的分子量、大小和特性粘度是通過 Viscotek TDA和SEC-MALS 20系統進行測量的。然后繪制出構象圖和Mark-Houwink圖，二者均清晰地顯示出不同樣品的不同結構。從數據可以看出，不同的多糖之間分子結構的差異非常明顯，很容易觀察出來。

以前，使用單檢測器GPC系統無法得出此種程度的表征結果。通過將光散射和特性粘度檢測器與GPC結合使用，則可對天然和合成聚合物樣品進行詳細的表征。