研究背景：麻醉后處死動物在應激方面的研究是普遍的，但是麻醉對結果的影響研究不足。我們的目的是探究不同麻醉劑的影響，如在大鼠急性應激反應時腹腔注射戊巴比妥鈉或吸入異氟烷。

方法：將大鼠隨機分為電擊（FS）和非應激對照組，進一步設定處死程序：直接斬首，腹腔注射戊巴比妥鈉或吸入異氟烷后斬首。再設定一組對照組腹腔注射生理鹽水后斷頭處死。測定血漿皮質酮（CORT），睪酮和雌二醇，下丘腦應激相關分子表達的促腎上腺皮質激素釋放激素，血管加壓素和催產素，與額葉相關分子表達的NMDA受體NR2B亞單位，GABAA受體和神經元煙堿型乙酰膽堿受體。

結果：直接斬首組和異氟烷電擊（FS）顯著增加血漿皮質酮（CORT），而腹腔注射戊巴比妥鈉注射后，這種應激反未出現。非應激對照組動物，無論是注射生理鹽水還是戊巴比妥鈉都引起的血漿皮質酮（CORT）顯著增加。各組間性激素水平和大腦中的相關分子mRNA的表達差異顯著。

結論：混合注射麻醉導致動物應激反應，妨礙了血漿皮質酮（CORT）水平，但影響血漿性激素水平和大腦mRNA的表達。異氟烷吸入應激反應影響較少，而且從實驗動物倫理的角度來看，也是最理想的。

1.簡介
應激反應與情感性精神障礙病因學的關系[ 1 ]促進了動物模型應激反應的研究。壓力調節系統如下丘腦-垂體-腎上
腺（HPA）軸活動已在不同的應激活動下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）活性研究是由促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）驅動的物質主要來自下丘腦室旁核（PVN）的下丘腦。HPA軸的最終目標的壓力荷爾蒙激素，這主要是在大鼠皮質酮（CORT）。我們和其他組發現性激素如睪酮（T）、雌二醇（E2）和神經肽，如精氨酸加壓素（AVP）和催產素（OXT），在壓力反應[ 2 ]起重要調節作用。

處死動物的方式來研究可能的混淆作用引起了我們的關注。相關的生物學研究處死動物一般有兩種方法：直接斷頭或給藥后麻醉斷頭。斷頭可能是一個潛在的額外的壓力，這也取決于研究者的經驗，會影響研究結果[ 3 ]。無意識的麻醉藥似乎減少了額外的壓力[ 4 ]。然而，一些藥物，如苯巴比妥，也會引起額外的應激反應，表現為增加血漿CORT水平[5,6]。此外，麻醉劑影響興奮性受體抑制大腦的活動，包括N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體NR2B亞單位與神經元煙堿型乙酰膽堿受體（nnachr），通過抑制受體刺激如GABAA受體（GABAAR）[ 7 ]。到目前為止是否經常使用麻醉劑如腹腔注射（ip）戊巴比妥鈉或異氟烷吸入可能影響大鼠腦mRNA表達與在急性應激反應有關的分子，也不清楚腹腔注射戊巴比妥鈉如何引起動物的附加應激。

因此我們分析了經驗豐富的研究員用不同方式處死動物的影響，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉和吸入異氟烷后電擊（FS）和不刺激對照組比較，比較內容包括血漿CORT，T和E2水平，下丘腦CRH mRNA水平，AVP和OXT，與額葉NMDA-NR2B、 GABAAR、 mRNA和nnAChR的表達水平。

2.實驗方法

2.1 倫理陳述
所有動物使用和實驗均按照實驗動物的使用和保護指南(National Research Council, 1996, USA)，經中國國家委員會浙江分會批準。盡最大努力來減少動物的痛苦，并盡可能少用動物（更多細節見補充材料1）。

2.2 電擊大鼠
雄性SD大鼠（體重300-330g），飼養在25-27℃房間，12h明暗交替，自由攝食飲水。給予一周時間適應環境。擬定0.5mA電刺激5s，然后間隔25min。動物居住條件和衛生細節連同FS協議見輔助材料1.將大鼠隨機分為7組：1）對照或2）FS通過直接斷頭處死大鼠（分別為黃連解毒湯，FSD）；3）控制或4）腹腔注射3.5%戊巴比妥鈉（3ml/kg）5分鐘后FS大鼠斷頭處死（分別為和FSP）；5）對照或6）4%異氟醚在吸氧后1–2分鐘FS大鼠斷頭處死（綜合技術研究所或FSI組）；7）額外的對照組腹腔注射生理鹽水（3毫升/公斤）5分鐘后斷頭處死（CTR）。每組7只或8只大鼠。由相同的研究人員，電擊（FS）30分鐘內處死動物，實驗在每日15:00-16:00之間。采血、離心、收集血漿。迅速取出大鼠大腦、下丘腦和額葉進行解剖。根據Paxinos和Watson的圖集[ 10 ]下丘腦解剖位置是前囟點1.7mm。
所有的樣品都是立即凍結并存儲在−80°C直到進行檢測。所有程序均符合當地動物保護委員會的有關規定和法律。

2.3 血漿激素水平測定
采用酶聯免疫法測定血漿CORT水平(RE52211, IBL Corporation, Germany)。變異(CV)的內和間變異系數分別為3.38%和10.50%。用放射免疫分析法檢測血漿T水平(IM1087, Immunotech Corporation, USA)，一個內和批間CV分別為2.6%和11.9%。通過酶聯免疫試劑盒測定血漿E2水平(ADI-900-174, Enzolifesciences Corporation, USA)，一個內和跨3.9%和11.37%的CV，分別。

2.4 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（PCR）在下丘腦和額葉的mRNA表達分析
對下丘腦CRH，AVP mRNA與額葉NR2B，GABAAR和nnachr表達水平的檢測方法是光電導繼電器Q-PCR�？傊�，全部 RNA用Trizol提取劑和基因與PrimeScript RT試劑盒合成。Q-PCR采用Bio-Rad cfx96觸摸熒光PCR儀進行比[ 11 ]。所有的程序都是按照制造商的指示進行的。引物對CRH，AVP，OXT，NR2B，GABAAR-受體，nnachr和β肌動蛋白mRNA設計與程序Primer Premier 5。作為管家基因（見輔助材料2）

2.5 統計
當數據被發現是不是正態分布，采用非參數測試。多組比較，第一–沃利斯試驗采用Kruskal，如果有顯著性差異，組間比較進一步進行–Mann Whitney U檢驗。P＜0.05被認為是重要的。

3. 結果

3.1 血漿激素水平
FSD組血漿激素明顯升高（P＜0.001），但是和CTRD組相比T檢驗（P=0.834）或E2 levels（P=0.248）無顯著差異。     
類似結果被觀察到，當FSI組和CTRI組相比較，血漿CORT水平顯著升高（P＜0.001）。血漿T（P=1.000）和E2 Levels（P=0.563）沒有出現明顯的變化。相比之下，FSP集團并未顯示血漿CORT顯著變化（P = 0.132），T（P = 0.848），或E2水平（P = 0.949）與CTRP組比較（圖1）。此外，兩CTRP（P = 0.008）和點擊率（P = 0.004）組明顯高于血漿CORT水平比CTRD組，而綜合技術研究血漿CORT水平（P = 0.248）與CTRD組比較未顯示出有顯著差異（圖1）。

圖1

3.2 下丘腦和額葉相關分子表達
在電擊FS刺激處死大鼠實驗無任何組在下丘腦CRH，AVP mRNA表達和催產素或額葉NR2B，GABAAR，和nnachr有顯著性差異（圖2）。

圖2

4. 討論
目前研究表明，斷頭前腹腔注射戊巴比妥顯著增加基礎血漿CORT水平，這可能會影響研究結果。另一方面，斷頭前異氟烷吸入麻醉不影響基礎血漿CORT水平。事實上，生理鹽水腹腔注射對照組增加基礎血漿CORT水平，表明是腹腔注射而不是戊巴比妥造成額外的刺激。我們還發現，麻藥的使用，即腹腔注射戊巴比妥和吸入異氟烷，電擊FS 30min后不干擾測量腦應激相關mRNA分子表達。

我們發現，FS后直接斷頭處死大鼠或吸入異氟烷后斷頭處死大鼠顯著增加血漿CORT水平，這與之前的研究是一致的[ 12 ]。然而，由于在非FS組皮質醇水平升高，這種應激反應在腹腔注射戊巴比妥鈉注射液組沒有出現。由于腹腔注射戊巴比妥鈉和腹腔注射生理鹽水造成的對照組血漿CORT相似的增長，而額外增加血漿CORT水平在異氟烷組或直接斷頭對照組未出現，額外的應激明確是來自注射本身，而不是對戊巴比妥鈉化合物的效果，混淆了結果。應該指出的是，FS電擊雄性SD大鼠20min后我們沒有觀察到血漿中T、E2水平或下丘腦CRH，AVP和oxtmrna水平或在額葉皮層NR2B， nnachr GABAA受體mRNA的表達顯著差異。在某些區域的某些相關分子的表達可能沒有回應，直到30分鐘或更多的雄性SD大鼠的應激后。在下丘腦PVN CRH mRNA開始明顯增加，2 h和1 h的AVP mRNA開始增加約束應力[ 13 ]出現，雖然2小時固定[ 14 ]后OXT mRNA沒有顯示變化，可4小時腹腔注射高滲鹽水后顯著增加[ 15 ]。這些數據可以解釋在我們的研究中觀察到的與應激有關的分子改變mRNA的表達。應當指出，然而，那其他一些分子mRNA的表達，如黑皮質素受體亞型4（MC4R）和阿黑皮素原，表明雄性SD大鼠下丘腦顯著增加，在30分鐘內從一個類似的FS電擊刺激開始，在杏仁核的[ 16 ] CRH mRNA和MC4R基因mRNA表達明顯增加，說明FS引發變化的分子和腦區時相關的。

我們數據表明，電擊30min后，斷頭前麻醉大鼠不影響下丘腦和額葉相關分子血漿激素水平或mRNA的表達，但實施方式可能影響血漿CORT水平，異氟烷吸入后斷頭似乎維持應激反應的完整，而且從倫理學角度也是應激反應研究的最佳選擇。