動物模型是現代生命科學研究的重要工具，特別是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人類生理病理機制研究及新藥研發中起著不可替代的作用。近幾年來，制 備動物模型的基因修飾技術層出不窮，這不僅包括傳統ES打靶、TALEN、CRISPR/Cas9， 還有TetraOne基因敲除新技術。如此繁 多的技術該如何選擇？本文將對這四種技術的原理、特點、缺陷及未來發展趨勢作系統的介紹和對比。

１、傳統ES打靶基因敲除——成熟、修飾準確、效果穩定，但制作周期長達一年

基于胚胎干細胞（ES）的同源重組技術俗稱“傳統的基因打靶技術”。因具有技術成熟、修飾準確、效果穩定等優點而受到眾多科學家一致好評，此外，世 界上所有重要的的基因敲除小鼠模型均通過此技術制備。盡管新興核酸酶修飾技術如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等相繼出現，但基于ES細胞的 同源重組技術依然是唯一可以滿足所有基因組修飾要求的技術。

基因打靶就是通過同源重組技術將外源基因定點整合進靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的。基因打靶技術目前已 被廣泛認為是一種理想的特定修飾與改造生物體遺傳物質的最佳方法，其中包括了多種不同的基因敲除和敲入系統，特別是條件性和誘導性基因打靶系統的建立，使 得對基因在時間和空間上的靶位修飾更加明確、效果更加精確可靠。但其存在周期長的缺陷，通常制作周期10-12個月。

2、TALEN基因敲除——周期短，但存在馬賽克現象和脫靶現象

TALEN技術是一種新的分子生物學工具。科學家發現，來自一種植物細菌的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關 系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序 列，以及識別序列經常受上下游序列影響等問題，且具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡單方便。但因為脫靶的問題，利用TALEN技術進行 小鼠的基因修飾仍然無法取代傳統技術。加上存在馬賽克現象，所以在做基因敲入（KI）和其他應用時候也必須謹慎的進行檢測。

3、CRISPR/Cas9基因敲除——周期短，但存在馬賽克現象和脫靶現象

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats） 是最新出現的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。 CRISPR是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性 免疫防御機制。在這一系統中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans- activating RNA）結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈 DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統能夠對小鼠和大鼠基因組特定基因位點進行精確編輯，目前已經成功應用于大小鼠基因的 KO/KI模型制備，其原理也是對目的片段產生特異的切割后，修復過程中產生移碼突變或者是片段缺失，或者是在切開位置產生片段插入等現象。

4、 TetraOne基因敲除——成熟、修飾準確、效果穩定，制作周期只需6個月

TetraOne基因敲除是業界推出的新技術，沿用ES細胞同源重組的技術體系，采用獨特的建系和基因改造技術建立了具有遺傳優勢的TetraOne ES細胞系，通過胚胎發育前期的顯微注射，使TetraOne ES細胞100% 代替內源ES細胞，實現跨越“嵌合體”階段從而快速獲得去Neo雜合子小鼠的基因打靶專利技術。

TetraOne技術是基于ES細胞打靶技術的金標準，通過同源重組技術將外源基因定點整合進靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造基因組某一基因的目的。同時TetraOneTM 技術還具有核酸酶技術周期短的優勢，將傳統ES打靶技術的周期縮短一半，并且不會像核酸酶技術那樣帶來脫靶效應和馬賽克現象，在核酸酶技術尚未成熟之前，TetraOne技術將是研究者最佳的選擇。

TetraOne基因敲除技術的原理

TetraOne基因敲除技術采用獨特的建系和基因改造技術建立了具有遺傳優勢的TetraOne ES細胞系，通過在胚胎發育前期進行顯微注射，使TetraOne ES細胞100%代替內源ES細胞，實現跨越“嵌合體”階段從而一步直接獲得TetraOne小鼠的基因打靶專利技術。實驗結果顯示，TetraOne小鼠的特征均與傳統ES打靶技術產生的F1代小鼠一致。