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POD辣根過氧化物酶的溶解性及分類說明

瀏覽次數:3481 發布日期:2016-9-7  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

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說明:POD是一種具有氧化還原酶性質的血紅素蛋白。用于生化研究,是酶標記法所用的一種主要酶。也用于生物液體中葡萄糖和半乳糖的測定。

別名:Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase;Horseradish peroxidase;HRP

CAS#:9003-99-0    外觀:棕褐色結晶或凍干粉    類型:Type VI-A

酶活:250-330 U/mg固體    溶解性:溶于0.1 M 磷酸鹽緩沖液, pH 6.0,參考濃度10mg/ml

HRP是一種分子量達44 000的糖蛋白,由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合而成,中性糖和氨基糖約占18%,主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每一個HRP分子中含一個氯化血紅素IX作輔基,該輔基在403nm波長處有最大吸收峰,而去輔基的酶蛋白在275nm波長處有最大吸收。HRP在403nm的OD值與275nm的OD值之比,也就是所謂的RZ(Reinheits Zahl)值。RZ值僅說明血紅素基團在HRP中的含量,并非表示HRP制劑的真正純度,而且RZ值高的HRP制劑,并不意味著酶活性也高。但可以一純酶溶液在10mm光徑403nm波長下的吸光度來計算酶濃度[1%(W/V)酶溶液吸光度為22.5,濃度為227umol/L]。純HRP干燥貯存于–20oC可保持穩定,使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸鈉、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L細胞色素C(pH 7.4)溶液作為基質冷凍保存,可使酶結合物穩定數年。HRP對熱及有機溶劑的作用比較穩定,用甲苯與石蠟切片處理或用純乙醇或l0%甲醛水溶液固定做冷凍切片,均不能使其活性改變。氰化物或硫化物在10–5~10–6mol/L濃度時具有可逆性地抑制HRP的作用;氟化物、疊氮化合物或羥胺僅在高于10-3mol/L濃度時抑制HRP;HRP還可被羥甲基過氧化氫不可逆地抑制。強酸也是HRP的強烈的抑制劑。

因此,在酶免疫測定常選用上述的某些化合物如氟化鈉、疊氮鈉和強酸等作為酶反應的終止劑。此外,在配制酶免疫測定的稀釋緩沖液時,為防止酶失活,應避免使用疊氮鈉作防腐劑。HRP的同工酶主要可分為三種類型:①含糖量高的酸性同工酶。②等電點接近于中性(或微堿)的含糖量相對較低的同工酶。③含糖量低的堿性(PI>11)同工酶。酶免疫試驗中所使用的HRP,以PI為8.7~9.0的所謂“C”同工酶為主要組成成分,其他同工酶的活性則很低。“C”同工酶的共價結構由2個密切接近的區域組成,血紅素基團則位于其間而成夾心結構,糖鏈以8個不同的部位結合于多肽。天然的酶所帶的純電荷極少;無游離的。—氨基,僅有2個可測出的組氨酸,6個賴氨酸似乎全被糖鏈外殼所遮蓋。因此,HRP一般僅有1~2個可用于耦聯的氨基。

根據HRP的催化特性,ELISA中一般使用過氧化氫(H2O2)作為HRP底物之一,在供氫體(即色原底物)存在時,HRP與H2O2的反應迅速而又專一。由圖4可見,HRP被H2O2二價地氧化形成復合物I,而復合物I又可與氫供體的二步連續的單價相互作用而還原至起始狀態。復合物Ⅱ是被氧化的帶一個電子的中間產物,當H2O2過量,由于復合物Ⅲ或Ⅳ的形成,酶活性受抑制(以后補上)。30%的H2O2并不穩定。由于H2O2既為HRP的底物,也為其抑制劑,因而ELISA要想得到滿意的測定結果,H2O2必須限定在一定的濃度范圍內,終濃度通常為2~6 mmol/L。然而在實際研究工作中,一般很少注意這一點。大多數研究者所使用的H2O2的濃度常較理想反應所需的量大2~4倍。吸附于固相的HRP較游離的HRP更易受過量H2O2的抑制。如果30%H2O2貯存液濃度經測定證實確為30%,則稀釋10 000—12 000倍常是較為理想的底物。H2O2的摩爾消光系數為10mm光徑240nm波長下為43.6,因此,可通過這種方式來檢測H2O2工作溶液的濃度。

固相ELISA中,當溫度高于20oC時,HRP活性常較低,在底物溶液中加入非離子去垢劑聚山梨醇-20或TritonX-100可延遲HRP的失活,且可使反應溫度加大,但非離子去垢劑的這種酶活性保護效應依氫供體的不同而有差異。如以2,2’-聯氮-雙-[3-乙基苯并噻唑啉]-6-磺酸(ABTS)為氫供體,則只能保護20%的酶活性,而以鄰聯茴香胺(ODA)為氫供體時,酶活性的保護提高至90%。

HRP之所以是迄今為止在ELISA中應用最為廣泛的標記用酶,主要是因為其一方面易于提取,價格相對低廉;另一方面性質穩定,耐熱及有機溶劑的作用,與抗原或抗體偶聯后,活性很少受損失。

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