銳博生物：外泌體miRNA研究案例：腫瘤細胞分泌的exo通過其包含的miR-21促進轉移前表型
銳博生物：教科書般的外泌體miRNA研究案例
近日，四川腫瘤醫院的朱桂全老師在Cancer Research發表了一篇研究外泌體miRNA與癌癥的文章。小編認為該研究的思路對廣大外泌體研究者具有很好的參考作用，所以今天給大家帶來這篇文章的詳細解讀。
1、首先，提取exo
方法：分別從缺氧 (1%O2) 或正常 (20%O2) 培養的OSCC(口腔鱗狀細胞癌)細胞培養基上清提取exo (外泌體)，掃描電鏡觀察形態，Western blot檢測exo marker CD63和CD81
掃描電鏡觀察顯示提取產物直徑為50～200nm。
2、缺氧腫瘤細胞分泌的exo能影響正常腫瘤細胞嗎？
方法：給缺氧exo (缺氧培養的細胞分泌的exo) 添加熒光PKH67標簽，孵育OSCC細胞，熒光顯微鏡下觀察
共聚焦顯微鏡顯示PKH67標記的exo(綠色)被OSCC細胞內化吸收。
3、缺氧exo對正常OSCC細胞遷移和入侵有何作用？
方法：敲降細胞的HIF-1α或HIF-2α，提取exo后孵育細胞，進行細胞劃痕實驗
缺氧exo增強細胞遷移和入侵，但敲降后exo不能。
4、為什么缺氧exo有此功能？或許是exosomal miRNA起的作用
方法：OSCC細胞株Cal-27正�；蛉毖跖囵B24h，從細胞培養基提取exo，提取總RNA，進行miRNA測序 (exo提取、測序、生物信息分析工作由銳博生物完成)
reads中非編碼RNA的量。Normoxia，氧正常；Hypoxia，缺氧
Venn圖(文氏圖)顯示兩組exo的unqiue和ovelapping miRNA
heatmap(熱圖)顯示兩組exo中差異表達的miRNA。紅色，高豐度表達；綠色，低表達；黑色，中間值�；虮磉_數據通過Illumina HiSeq2500平臺二代測序(銳博生物提供)獲得
qRT-PCR驗證缺氧exo中表達量增強的三條miRNA
5、通過測序得到了差異表達miRNA，下一步做什么？
研究者從3條miRNA中選擇了差異顯著且表達最高的miR-21作為接下來的研究對象，研究它與HIF-1α、HIF-2α的關系。
敲降HIF-1α、HIF-2α，檢測細胞、exo中miR-21水平；ChIP實驗看相互作用
缺氧誘導細胞、exo表達miR-21，是通過HIF-1α、HIF-2α與miR-21 HRE區結合實現的。
再研究miR-21對細胞遷移與入侵的作用。
方法：敲降缺氧或正常細胞的miR-21，提取exo后孵育細胞，進行劃痕實驗；敲降HIF-1α、HIF-2α后再過表達miR-21，即挽救實驗
miR-21是缺氧exo誘導細胞遷移、入侵所依賴的。
挽救實驗。C：腫瘤細胞刮痕實驗。白線：0h成像；藍線：24h成像。D：exo處理OSCC細胞后進行侵入實驗
6、細胞水平實驗做完整了，接下來開展動物實驗
方法：將Cal-27細胞皮下注射到nu/nu小鼠，生成60 mm3腫瘤。注射缺氧或正常exo (10ug) 到移植瘤中央，檢測各種指標
腫瘤exo的miR-21誘導移植瘤的生長和轉移
7、臨床樣本分析
從OSCC病人血清提取exo (OSCC exo)，檢測miR-21水平。
OSCC exo中miR-21水平更高，此水平與T stage 、淋巴結轉移及HIF-1α表達相關。
8、總結
本研究發現缺氧exo孵育細胞后有特殊的表型，對缺氧和正常exo進行miRNA測序，獲得了差異表達的miRNA；接著敲降miRNA及其相關的基因，提取exo后孵育細胞，回到細胞中研究exo、miRNA的功能；最后動物腫瘤模型與臨床數據進一步支持細胞實驗結果，證明了低氧微環境下腫瘤細胞分泌的exo通過其包含的miR-21促進轉移前行為。
缺氧腫瘤exo可以轉移到氧正常區域、使非缺氧細胞轉化為轉移前表型
原文：Li L, et al. Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype. Cancer Res. 2016 Mar 18.
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