91成人国产网站在线观看_久久久久亚洲av成人毛片韩_国产偷窥真人视频在线观看_乳揉みま痴汉电车中文字幕_欧美日韩精品一区二区三区_九色视频网站

English | 中文版 | 手機版 企業登錄 | 個人登錄 | 郵件訂閱
當前位置 > 首頁 > 技術文章 > 利用EarlyTox細胞活力檢測試劑盒評估GM-CSF和TNFα誘導的細胞凋亡

利用EarlyTox細胞活力檢測試劑盒評估GM-CSF和TNFα誘導的細胞凋亡

瀏覽次數:3292 發布日期:2017-8-28  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

前言:

腫瘤壞死因子(TNFα)是一個關鍵的細胞炎癥因子,它可以通過許多細胞通路來調控各種細胞事件。此因子是在造血細胞中引起凋亡而被人們熟知的,如U937,通過激活細胞內半胱天冬酶的級聯過程。另一方面,粒巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是 造血生長因子成員之一,可促進增殖和/或分化。然而,有報道稱U937細胞會應答 GM-CSF而發生生長抑制和凋亡。因為TNFα和GM-CSF都會在U937細胞中引起 凋亡,但這兩種細胞活素之間有著不同的時間進程。當兩者結合起來,兩種細胞活素的高度協同作用便會被觀察到。

EarlyTox™細胞活力試劑盒是評價細胞生 長條件的一類試劑之一,包括細胞活性和各種凋亡事件。這些試劑設計為均相免洗實驗并針對熒光微孔讀板機做了優化。這里,我們使用三種不同的試劑盒, Live/Dead測定、Caspase-3/7 R110測定和Caspase-3/7 NucView 488測定來檢測TNFα 和GM-CSF處理U937細胞的效果(圖 1)

• EarlyTox™ Live/Dead檢測試劑盒包含兩種針對哺乳動物活細胞或死細胞的標記物。Calcein AM是一種廣泛用于活細 胞的標記物,而溴化乙錠二聚體-III (EthD-III)通過受損的細胞膜進入死細胞與DNA結合以產生明亮的紅色熒光。

• EarlyTox™ Caspase-3/7 R110檢測試劑盒提供一步、均相測定,只需細胞裂解 來對凋亡過程進行終點法分析。

• EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488 檢測試劑盒能夠通過利用NucView 488 Caspase-3底物在未受損細胞群中檢測 凋亡細胞。這種試劑對細胞無毒并且可 用于凋亡的動態學研究。

在這一基于細胞的實驗中,熒光信號通過 SpectraMax® i3x微孔讀板機上底讀孔域掃 描功能進行檢測,可獲得孔底12個位置的 平均信號以避免因為潛在的細胞生長不均 所造成的孔與孔之間的差異。

 

材料:

• U937細胞(ATCC Cat.# CRL-1593.2)

• 細胞因子:

• 人類TNFα (Peprotech Cat# 300-01)

• 人類GM-CSF (Peprotech Cat# 300-03)

• EarlyTox細胞活力試劑盒(Molecular Devices, LLC):

• EarlyTox Live/Dead檢測試劑盒(Cat.# R8340)

• EarlyTox Caspase-3/7 R110檢測試劑盒(Cat.# R8346)

• EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488檢測試劑盒(Cat.# R8348)

• PBS•96-孔,平底,底透,黑色TC-處理的微孔板(Corning cat. #3904)

• SpectraMax i3x多功能微孔讀板機和 SpectraMax® MiniMax 300成像細胞計數儀

方法:

細胞培養和處理

U937細胞培養在RPMI1640培養基中,添加10%FBS和青霉素/鏈霉素。

實驗當天,細胞以100,000細胞/80 µL/孔接種。每孔加入20 µL的5X濃度細胞因子,其終濃度為1X且體積為100 µL。在37C、5%CO2下孵育處理24或48小時

細胞活力和凋亡測定

處理之后,準備好的試劑按照以下描述添 加于每孔中。

活/死測定:2X的calcein AM/EthD-III 工作液由calcein AM和EthD-III儲存液加入到PBS中配成濃度6 µM制成。100 µL的2X工作液添加于每個檢測孔中,終體積為 200 µL且每種染料的終濃度為3 µM。孔板 在室溫下孵育1小時,避光。使用如表1中的設置在SpectraMax i3x讀板機上檢測熒光。

Caspase-3/7 R110測定:底物測定緩沖液 由酶底物(AC-DEVD)2-R110 (2 mM)加入細胞裂解/測定緩沖液中并以50 µL對1 mL的 比例混合而成。100 µL底物測定緩沖液加 入到每個孔中,形成每孔終體積為200 µL 和終濃度為50 µM體系。樣品接下來在室溫下避光孵育1小時。使用表1中的設置在 SpectraMax i3x讀板機上檢測熒光。

Caspase-3/7 NucView 488測定:10µM2X的NucView 488底物工作液混合于PBS中。100µL底物工作液加入含有100 µL細 胞和培養基的孔中形成終濃度為5µM。細 胞在室溫下避光孵育1小時。使用 SpectraMax MiniMax細胞計數儀在 541nm綠色熒光通道下進行圖像采集,或者在SpectraMax i3x讀板機上檢測。請見 表1讀板機設置。

結果

結果顯示U937細胞在用TNFα處理時會以劑量和時間依賴的方式經歷凋亡過程。 GM-CSF對U937細胞處理達48小時卻無任 何效果。然而,可以觀察到當細胞與TNFα和GM-CSF混合物一起孵育時會出現明顯的協同作用.曾經報道過單獨的GM-CSF 相對于TNFα需要更長時間(72小時后)才能 通過caspase 3類通路誘導U937細胞的凋亡,而這兩種細胞因子的協同作用卻可以 在24小時后觀察到。在我們的研究中,這一協同性直到48小時后才變得明顯。請見圖2-5。

總結

通過使用三種不同試劑來檢測細胞凋亡的不同數據,我們闡明了即混即讀式的實驗模板可簡化懸浮細胞的測定過程。 SpectraMax i3x讀板機的孔域掃描功能降低了孔與孔之間的差異,校正了整孔細胞生長和分布不均一的問題。細胞活力檢測 試劑家族提供給研究者們多種多樣的檢測 凋亡和/或細胞死亡等細胞事件的有力工 具。


參考文獻

Okuma E., Saeki K., Shimura M., Ishizaka Y., Yasugi E., Yuo A. Induction of apoptosis in human hematopoietic U937 cells by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: possible existence of caspase 3-like pathway. Leukemia (2000) 14, 612-619.


發布者:美谷分子儀器(上海)有限公司
聯系電話:4008203586
E-mail:info.china@moldev.com

標簽: 細胞試劑盒
用戶名: 密碼: 匿名 快速注冊 忘記密碼
評論只代表網友觀點,不代表本站觀點。 請輸入驗證碼: 8795
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話:021-64166852;13621656896 E-mail:info@bio-equip.com
主站蜘蛛池模板: 欧美精品日本 | 免费在线一区二区三区 | 东京热av无码精品 | 做爰吃奶全过程免费的网站 | 成人免费观看视频大全 | 久久久免费精品国产一区二区 | 亚洲成精品自拍 | 亚洲熟女少妇精品 | AV导航第一福利网 | 乱人伦人妻中文字幕无码久久网 | 国产亚洲精品久久久久久青梅 | 最近新中文字幕大全高清 | 免费观看一区二区 | 日日碰狠狠添天天爽五月婷 | 大香伊蕉国产 | 亚洲一区二区视频 | 青青伊人久久 | 午夜高清国产拍精品 | 久久精品aaaaaa羞羞羞 | 久久久亚洲 | 91福利精品第一导航禁漫天堂 | 日韩在线中文高清在线资源 | 久久一日本道色综合久久 | 少妇人妻互换不带套 | mimiai最新网站入口 | 亚洲熟妇AV一区二区三区 | 18精品久久久无码午夜福利 | 亚洲精品无码久久久久久久久久久久久 | 国产福利一区二区三区视频 | 97人人模人人爽人人少妇 | 成年av网站全部免费毛片 | 啊轻点灬大JI巴太粗熟妇 | 91夫妻在线 | 中文字幕一区av | 国产小毛片 | 久久精品在线观看视频 | 一区二区三区四区乱视频 | 日韩欧美视频免费在线观看 | aa一级片| 深夜福利小视频 | 久久国产精品成人无码网站 |