蝦源性成分核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書
蝦源性成分核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書
◆ 產品說明
物種鑒定系列中的過敏原鑒定試劑，可針對食品中過敏原成分的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于食品及其原料中過敏原蝦成分的檢測，可于一個反應中同時檢測蝦與北極蝦，檢出限為0.01%。（需注意：FAM通道的檢測引物為蝦的檢測引物，對海蟹、蝦/蟹爬、虎頭蟹、赤甲蟹有非特異性擴增。VIC通道的為北極蝦的檢測引物。）
◆ 產品組成（96測試）
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021132LⅡ |
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試劑 |
含量 |
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A-蝦源-P |
20μL × 8管× 12排 |
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NG-P |
100μL × 3支 |
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PG-蝦源-P |
100μL × 2支 |
- 適用儀器
ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。（可同時檢測FAM通道（494 nm）、VIC通道（538nm）兩種通道的熒光定量PCR儀）。
◆ 自備耗材和儀器
①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：樣本制備區。
2）第二區：模板添加區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆樣品處理
參照《SN/T 1961.10-2013 出口食品過敏原成分檢測 第10部分：實時熒光PCR方法檢測蝦/蟹成分》或其他標準處理樣品，制備的樣本保存待用。
樣品的采集和制備是過敏原成分鑒別的重要步驟，防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的規定執行。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
1.模板制備（樣本制備區）
建議使用配套動物基因組DNA提取試劑盒，具體過程詳見產品說明書。
2.添加模板（模板添加區，放置于冰盒上進行）
剪下所需測試數的已含有反應液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-蝦源-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應。
3.擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，使用FAM和VIC通道。
按下列條件設置擴增反應：
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PCR循環 |
熒光收集位點 |
||
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95℃ |
30秒 |
1個循環 |
— |
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95℃ |
15秒 |
45個循環 |
— |
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60℃ |
40秒 |
※ |
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4.基線和閾值設定
基線調整取3-15個循環的熒光信號，閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線（無規則的噪音線）的最高點，且Ct值不出現任何數值為準。
◆結果判定
同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品FAM與VIC通道均無熒光增幅現象，判斷樣品中未檢出致敏原蝦成分。
同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，檢測樣品有明顯的熒光增幅曲線，且Ct值≤35，判斷樣品中檢出致敏原蝦成分。
同時進行的陰性、陽性、空白對照實驗結果正常，若檢測樣品熒光增幅曲線的Ct值在35-40之間，則應重新進行實時熒光PCR反應。再次擴增后的結果Ct值仍在35-40之間，可判斷樣品中檢出致敏原蝦成分，否則可判斷樣品中未檢出過敏原蝦成分。
FAM與VIC通道其中有一個檢測結果為陽性，即可判斷該樣品中檢出致敏原蝦成分。
- NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
