動物細胞活性內質網分離試劑盒產品使用說明書

主要用途

YIJI動物細胞活性內質網分離試劑是一種旨在通過機械或化學處理和差速離心方法，從動物細胞中分離出完整的活性內質網細胞器組分的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種細胞（人體、動物、昆蟲等）的活性內質網的制備。其制備物產量高，活性保證，可以被用于細胞色素P450系統外源化合物（xenobiotics）代謝、脂類代謝、內質網膜蛋白和腔內蛋白等研究。產品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩定，分離產量高。

技術背景

內質網（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的細胞器組分，構成細胞內小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網絡結構，負責蛋白轉譯、折疊和轉運成為細胞膜成分（例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），負責鈣離子區隔（sequestration），以及糖原、固醇類和其它大分子的生產和儲存等功能。內質網分成三種：粗面內質網（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面內質網（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌質網（sarcoplasmic reticulum；SR）。根據細胞代謝的需要，粗面內質網和滑面內質網會互相轉換。粗面內質網通過核糖體合成蛋白質并分類；滑面內質網進行固醇、碳水化合物和藥物代謝等。肌質網的主要功能為儲存和釋放鈣離子。內質網的分離是現代細胞生物學研究的常用手段之一：第一，通過機械或化學方法破裂組織細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得內質網；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的內質網。 

產品內容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI凈化液（Reagent C）   毫升

YIJI強化液（Reagent D）   毫升

YIJI分離液（Reagent E）   毫升

YIJI保存液（Reagent F）   毫升

YIJI活性液（Reagent G）   微升

產品說明書       1份

保存方式

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細胞脫離

完全細胞培養液：用于細胞處理所需的培養基

50毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

平式搖蕩儀：用于混勻

實驗步驟

• 組織勻漿法

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent G）凍融，然后移出xx微升YIJI活性液（Reagent G）、xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心15分鐘，速度為12000g
• 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內質網組分
• 如果到此終止，即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• 或如果繼續分離，按照下列選擇步驟操作
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E），混勻顆粒群
• （選擇步驟）轉移到15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）再加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E）
• （選擇步驟）置于冰槽里
• （選擇步驟）放在平式搖蕩儀上混勻15分鐘，速度為100RPM
• （選擇步驟）放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為8000g
• （選擇步驟）移取上清液到2個預冷的6毫升超速離心管，保留離心后沉淀顆粒――此步驟獲得粗面內質網組分（沉淀顆粒）
• （選擇步驟）加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）放進超速離心管到4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得滑面內質網組分
• （選擇步驟）分別加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻合并轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）全部放進－70℃冰箱里保存

• 化學處理法

實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent G）凍融，然后移出xx微升YIJI活性液（Reagent G）、xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 重復實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 輕輕手擊震動培養瓶，使細胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A）
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 轉移到新的15毫升錐形離心管
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預冷的xx微升YIJI強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入預冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為12000g
• 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內質網組分
• 如果到此終止，即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里保存
• 或如果繼續分離，按照下列選擇步驟操作
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E），混勻顆粒群
• （選擇步驟）轉移到15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）再加入xx毫升YIJI分離液（Reagent E）
• （選擇步驟）置于冰槽里
• （選擇步驟）放在平式搖蕩儀上混勻15分鐘，速度為100RPM
• （選擇步驟）放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為8000g
• （選擇步驟）移取上清液到2個預冷的6毫升超速離心管，保留離心后沉淀顆粒――此步驟獲得粗面內質網組分（沉淀顆粒）
• （選擇步驟）加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）放進超速離心管到4℃超速離心機再次離心60分鐘，速度為100000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得滑面內質網組分
• （選擇步驟）分別加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• （選擇步驟）即刻合并轉移到1.5毫升離心管
• （選擇步驟）全部放進－70℃冰箱里保存

注意事項

• 本產品為10次（5 X 10⁷細胞/次）操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent F）
• 所有操作均須在4℃或以下狀態進行
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數為20至40下（或細胞顆粒消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數
• 對于難以裂解的細胞，采用物理勻漿法是優先推薦的技術處理
• 通常5 X 10⁷細胞的內質網含量為500至1000微克蛋白

11． 本產品所獲得的內質網純度和產量最為理想

12． 如果需要獲得95％以上純度的內質網，使用YIJI動物細胞高質純化內質網分離試劑盒

13． 內質網的標志蛋白是NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建議使用YIJI 組織NADPH細胞色素C還原酶活性比色法定量檢測試劑盒

• 本公司提供系列亞細胞結構分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定分離的內質網維持正常活性
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶