基因改造（包括敲除和敲進）小鼠已經成為現代生命科學基礎研究和藥物研發領域不可或缺的實驗動物模型，在生命科學、人類醫藥和健康研究領域中發揮著重要的作用。今天呢，就給大家介紹最傳統最穩定的基因改造技術：基于胚胎干細胞的同源重組技術。

Capecchi和Smithies早在在1989年根據同源重組（homologous recombination）的原理，首次實現了ES的外源基因的定點整合（targeted integration），即基因打靶（gene targeting），如果用外源抗性基因將基因上的一段重要序列替換掉，就成功將目的基因實現了基因敲除（gene knockout），利用這種ES的顯微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于這一工作，Capecchi和Smithies于2007年與Evans分享了諾貝爾醫學獎。

 

圖片來源^[1]

 

是不是感覺很高級？那么，問題來了：到底什么是同源重組呢？

 

首先，我們先了解一下什么是同源重組技術：

 

同源重組（homologous recombination）：是指發生在姐妹染色單體（sister chromatin) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。在基因改造小鼠制作過程中，需要針對目的基因兩端特異性片段設計帶有相同片段的重組載體，將重組載體導入到胚胎干細胞后外源的重組載體與胚胎干細胞中相同的片段會發生同源重組，簡言之，就是把想改造的部分各制備一段一模一樣的DNA序列（同源臂），然后同源臂之內的部分就會被替換掉了，如圖1所示：

 

 

圖1. 基因敲除鼠制作同源重組原理示意圖^[2]

 

了解同源重組技術的原理，那基于該原理，如何制備出基因改造小鼠呢？接下來我們以基因敲除為例，為大家詳細介紹一下基因敲除小鼠的制備流程：

 

圖2. 基因敲除小鼠制備過程示意圖^[3]

 

01 打靶載體設計與構建

 

    首先，第一步，要進行打靶載體的設計及構建。是將目的基因、與細胞內靶基因特異片段同源的DNA 片段，都重組到帶有標記基因(如neoR 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體。簡言之，就是把一個抗性基因插入到同源臂的兩端，利用“同源重組”把同源臂中的抗性基因替換到基因組對應同源臂中去。

同源臂內的抗性基因（我們一般用新霉素抗性基因，即有G418抗性，又名NeoR），我們一般叫“正篩選標記”，打靶載體同源臂外部分我們也會加入一個致死基因，叫“負篩選標記”。這兩個篩選標記是干什么用的呢？這里我們先賣個關子，稍后再做詳解~

 

圖3. 原理圖^[4]

 

02 電轉導入打靶載體

 

打靶載體制備完成后，將重組載體通過電轉的方法，導入同源的小鼠胚胎干細胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發生同源重組，用G418篩選轉染后的胚胎干細胞，得到陽性克隆 。 

 

03 ES細胞篩選

 

由于基因轉移的同源重組自然發生率極低，動物的重組概率為10^-2～10^-5，植物的概率為10^-4～10^-5。

那么，既然同源重組率這么低，如何確保篩到正確重組的陽性克隆呢？

還記得我們上文提到的打靶載體上的“正篩選標記”和“負篩選標記”吧？替換目的基因（或重要區域）的同時，插入一個抗性基因，即“正篩選標記”，可以確保得到ES細胞克隆中已經進行了重組；在打靶載體上同源臂外插入一個致死基因，即“負篩選標記”，可以防止打靶載體隨機插入造成的假陽性。正負篩選標記綜合起來，基本上可以確保拿到的ES克隆是打靶載體兩端通過同源重組插入的了，是不是很聰明呢？

當然即使通過正負篩選標記，得到的陽性克隆仍然有可能跟理想的插入有個別堿基或片段的出入，因此就需要進一步通過基因組PCR并測序和southern blot雜交技術（基因敲除小鼠檢測金標準）對上一步得到的陽性克隆進行篩選，最終得到穩定整合外源基因的胚胎干細胞陽性克隆，然后，將陽性克隆擴大培養并液氮保存。

 

圖4. 挑選出正確重組的ES細胞克隆是獲得正確陽性小鼠的關鍵步驟^[5]

 

04 ES細胞囊胚注射得到嵌合體小鼠

 

經歷千辛萬苦以后，我們終于得到了正確重組的ES細胞陽性克隆！

下面就是要將ES陽性克隆以囊胚顯微注射的方式將注入特定品系小鼠囊胚中，然后將囊胚移植到代孕的小鼠子宮中。等待后代小鼠出生后，我們就可以通過觀察小鼠的毛色比例（通常我們選用的ES細胞是黑色C57BL/6小鼠背景，而囊胚供體是白色balb/c背景），來判斷嵌合程度的高低，以及該小鼠的后代中可能獲得生殖系傳遞能力。

 

05 得到嵌合鼠，并獲得F1陽性雜合子小鼠

 

將嵌合體小鼠與適當品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通過PCR方式來檢測小鼠是否含有打靶序列。如有，則該小鼠就是具備生殖遺傳能力的F1代鼠了哦！

經過這一番介紹，大家對基于胚胎干細胞的同源重組技術是不是有了初步了解了呢？

百奧賽圖是國內最早使用近交系C57BL/6胚胎干細胞進行基因打靶，并且承諾實驗失敗全額退款的公司，我們自信，在基因改造小鼠方面，我們很專業！

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參考資料：

[1]https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2007/summary/

[2] Jun.,2006 Vol.14 No.2中國實驗動物學報

[3] https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2007/press-release/

[4] Jun., 2006 Vol.14 No.2中國實驗動物學報

[5] http://orthodoxnet.com/blog/2011/06/to-be-or-not-to-be-created/

 

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