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皮下荷瘤實驗的介紹及應用

瀏覽次數:9971 發布日期:2019-7-16 
腫瘤細胞系移植模型(CDTX)因易構建、成瘤率高、周期短等優點而廣泛應用,并且目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是通過該模型而被發現。本期咱們就首先為大家介紹,CDTX模型中看似最簡單卻深藏多種不確定因素的皮下荷瘤。

皮下荷瘤定義
腫瘤細胞系移植到同種或異種動物的皮下形成腫瘤塊,荷瘤是將腫瘤細胞移植到小鼠體內的專業說法,皮下荷瘤屬于腫瘤細胞系移植模型(CDTX),CDTX還包括各種轉移模型荷瘤、原位荷瘤等。

皮下荷瘤應用
一般用于抑制腫瘤生長(細胞增殖)的藥物的篩選檢測。如果單獨研究腫瘤在小鼠體內的生長,那么幾乎所有的腫瘤均可通過皮下荷瘤進行實驗研究。

第一部分:皮下荷瘤模型的幾個考慮因素
(1)腫瘤細胞系的選擇
腫瘤細胞株的選擇,是一個很麻煩的問題,卻是最重要的問題。有以下幾點要求:
① 不同腫瘤細胞系的成瘤率不同,需選取成瘤率高的細胞系;如乳腺癌細胞MCF-7,雖在體外應用多,但體內成瘤率差,生長慢,因此一般不選用;
② 腫瘤細胞根據分子標記分為多種,考慮成瘤率外,選擇時還需考慮實驗目的,如針對藥物靶點HER2,需要選擇HER2高表達的腫瘤細胞如SKBR-3,而不是HER2陰性的MDA-MB-231;再如研究靶向kras突變腫瘤的藥物,我們選取kras突變的(其突變類型又屬于突變率比較高的),又易培養且成瘤率好的A549。
③ 實驗用腫瘤細胞株多為人源或鼠源細胞系,根據實驗目的選擇,一般鼠源細胞系更易荷瘤,但是人源細胞系會更貼近人類腫瘤生長情況。
(2)小鼠品系的選擇
由于腫瘤細胞系主要分為人源和鼠源,因此小鼠品系的選擇要根據細胞系來源。
人源細胞系:為異種移植,應該選擇免疫缺陷的小鼠(如:nude,NOD/scid,NSG,詳情點
擊鏈接3.2 免疫缺陷動物(一)。
鼠源細胞系:為同種移植,選擇與腫瘤細胞系來源一致的小鼠(C57BL/6品系來源的黑色素
瘤細胞系B16F10就要選擇C57BL/6品系的小鼠)。不過裸鼠或其他免疫缺陷鼠的免疫系統
異常,不適用于篩選免疫調控藥物。
(3)接種部位
應選擇血管豐富且易操作的部位,如腋下、腹股溝、側腹部及頸背部等部位。其中腋下中部皮下較好,成瘤率高。如下圖所示:

Nude裸鼠腋下處皮下荷瘤(人源乳腺癌細胞系SKBR-3)
Balb/c小鼠腹股溝皮下荷瘤(鼠源結腸癌CT26)

第二部分:裸鼠皮下荷瘤步驟
一般更多的時候是選擇人源腫瘤細胞系,然而由于存在免疫排斥,需選擇裸鼠荷瘤。
下面以裸鼠為例,為大家詳細介紹皮下荷瘤的實驗過程
 腫瘤細胞的傳代擴增
取凍存于液氮的腫瘤細胞復蘇并擴增,確保腫瘤細胞的活力和良好的生長狀態
 計算細胞接種量
根據經驗,一般鼠源腫瘤細胞接種2~100萬/只,而人源腫瘤細胞則需要200-1000萬/只以
上。當然最好結合文獻來確定細胞接種量,在找不到相關資料的情況下,最高就用到1000
萬/0.1ml,不可再高(因為細胞懸液已達飽和狀態)。并且提前計算確定細胞數量,一般注射40只小鼠,至少需要準備50只小鼠的細胞量。
 準備裸鼠
一般選擇5-6W裸鼠,小于4W動物可能不耐受而過早死亡,大于6W免疫力會增強,不
易成瘤;
每批實驗只用同一性別動物,通常雌雄均可,但是根據研究的腫瘤類型及腫瘤細胞系選擇(乳
腺癌等要選擇雌性,前列腺癌等要選擇雄性)
⑷ 操作步驟(請觀看視頻)
① 接種時選擇好部位進針,建議接種前酒精棉球擦拭消毒進針位置;
② 向前方穿行,注射前針頭稍微動一動,能動說明在皮下,否則可能在皮內或者肌肉內;
③ 針頭在皮下走一段再注射,速度不可太快,一般體積為100-200μL(PBS或者無血清培養基稀釋細胞,若不易成瘤可添加matrigel促進成瘤),可看見明顯的鼓包;
④ 接種點離進針點盡量較遠,減少漏液和污染的可能;
⑤ 注射完畢后,緩慢退出針頭,盡量避免漏液;
⑥ 細胞需一直置于冰上,使細胞處于比較低的代謝狀態,一般2h之內不會有問題。
下面為皮下荷瘤視頻(包括各個部位的注射手法):
視頻
第三部分:后續實驗安排
⑴ 分組:一般來說皮下荷瘤主要用于抗腫瘤藥物的檢測,因此我們一般分為對照組,陽性藥物組,低劑量、中劑量及高劑量藥物組等;
⑵ 數量:荷瘤時每組不少于10只,考慮到小鼠成瘤率和死亡原因,最終實驗應至少可以獲取6個有效數據;
⑶ 給藥時間:一般接種7-10天后便可看到腫瘤長起,便可分組實驗(鼠源細胞系會更快);
⑷ 人道終點:動物倫理學規定,小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%,平均腫瘤直徑
不超過20mm,并且如果出現潰爛,造成感染或壞死時,應該中止實驗且對動物施行安樂死。
補充正常免疫小鼠的荷瘤
基本步驟與裸鼠荷瘤一致,只是比較繁瑣的是,由于野生型小鼠有毛發,所以需要剃毛(如
上圖Balb/c小白鼠腹股溝皮下荷瘤鼠源結腸癌CT26)
第四部分: 皮下荷瘤的幾點問答
⑴ 瘤子長不出來是怎么回事?
一方面可能是細胞狀態差,活力不好,或是腫瘤細胞不易成瘤,需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細胞系;一方面可能是小鼠周齡太大,或小鼠免疫排斥,建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠(Nod-scid小鼠,NOG小鼠> Nude裸鼠)
⑵ 小鼠瘤子長起來又消失?
腫瘤塊先縮小,后變大很常見,很可能是炎癥反應,腫瘤細胞被小鼠自身吸收,繼續觀察腫瘤細胞吸收之后是否經過幾周還能長出來,長不起來建議換鼠。
⑶ 均一性很差,腫瘤體積差距較大?
如果荷瘤分組發現小鼠腫瘤體積差距很大,這可能跟小鼠周齡及接種細胞量不一致導致,建議重新做實驗分組。
⑷ 是否可以在一只小鼠進行多個點荷瘤?
不可以,一只老鼠就只能接種一個點。因為一個老鼠身上有多個腫瘤塊的情況下,可能會相互影響。
⑸ 是否應用免疫抑制劑加速腫瘤生長?
如果裸鼠荷瘤不生長,可以參考文獻,用免疫抑制劑如環磷酰胺(抑制裸鼠NK細胞活性)
促進生長;不過最好不要為了縮短造模周期來加速生長,因為可能會造成潰爛,這樣就不得
不中止實驗。所以一般情況下,應盡量符合細胞系本身的生長特性,不應過多地人為的干擾。

皮下荷瘤實驗介紹就到此結束了,原來看似簡單的實驗卻有多種不可忽視的因素需要考慮。
簡單回顧一下,皮下荷瘤模型中細胞系和小鼠品系是最需要考慮的兩大因素,切記一定要多
查閱文獻并結合預實驗,進而找到最合適的皮下腫瘤模型。
 
發布者:上海邦耀生物科技有限公司
聯系電話:021-64340008
E-mail:service@bioraylab.com

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