細胞消化知多少？Darling我們分手吧！

每個做細胞實驗的人，不管去哪“浪”，
心里都會有個牽掛：

我的細胞
過兩天要傳代！

　　大部分組織細胞離體培養(yǎng)時，會以貼壁的形式生長（除了取自血、脾或骨髓的細胞）;完全培養(yǎng)基中的血清，含有許多帶陽性電荷的促細胞附著因子（層黏連蛋白 Laminine、纖維鏈接蛋白 Fibronectin 等胞外基質），能幫助細胞附著于帶陰性電荷的底物上（玻璃或塑料培養(yǎng)容器），并形成鍵結、貼壁伸展。

▲ 陽性電荷的促細胞附著因子，能幫助細胞附著于帶陰性電荷的底物上

　　所以當細胞長滿需要分盤的時后，就要想辦法讓細胞和培養(yǎng)底物說 再見！也就是所謂的～
 

細胞消化Cell Detachment

常見細胞消化法有以下三種：

　　直接用液體吹打或用刮刀，施予外力讓細胞與培養(yǎng)底物分離；適用于貼壁性弱的細胞傳代，但相較于其它消化方法，這種外力無法量化控制，細胞分散效果差，且可能會造成大量細胞破損，使內容物釋放到培養(yǎng)基，進而影響細胞傳代狀態(tài)。

▲細胞刮勺

　　細胞膜表面蛋白大多需要鈣、鎂離子來維持與胞外基質的穩(wěn)定鍵結，當然也包含各種黏附蛋白（例：整合素、鈣黏著蛋白、橋粒等），螯合劑會在不破壞細胞膜表面蛋白的狀況下，抽離這些離子，使黏附蛋白失活而減少細胞-細胞間及細胞-底物間的連接作用，讓細胞較容易在施予外力時，脫離培養(yǎng)底物并促進細胞分散。

　　0.02% EDTA是細胞傳代最常用的離子螯合劑，在37℃作用效果最佳（消化較敏感的細胞可在4℃作用），適用于消化一般貼壁性細胞或細胞表面標記實驗細胞。

　　但EDTA無法用血清終止其反應，所以在消化細胞后必須用緩沖鹽溶液（如：PBS）清洗離心，以免影響后續(xù)細胞貼盤效果。

▲ EDTA（黑）能螯合二價離子（紅）

　　用蛋白水解酶消化連接細胞及培養(yǎng)底物的蛋白質，適用于消化貼壁性稍強的細胞。

目前常用蛋白水解酶主要有兩種：

• 胰蛋白酶（Trypsin）

　　為一種來自于胰腺的絲氨酸蛋白酶；能辨識并剪切勝肽鏈中的賴氨酸（Lys）和精氨酸（‎Arg）羧基端（兩者之一緊跟脯氨酸狀況除外），所以能直接作用在細胞外的黏附蛋白及胞外基質上，但如果作用時間過長，細胞膜上內嵌的其他蛋白也會被水解，導致細胞膜受損；不同細胞適合的胰蛋白酶使用濃度及作用時間都各有不同。

• 膠原酶（Collagenase）

　為一種膠原水解酶，大多由細菌提取而來；能辨識并剪切Pro-X-Gly-Pro勝肽序列，而此序列在胞外基質主成分-膠原蛋白中出現的頻率比一般蛋白高很多，使得膠原酶能較專一的作用在胞外基質上，所以對細胞的傷害比胰蛋白酶小，且在鈣、鎂離子環(huán)境中仍有活性，可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，操作簡便，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。

細胞還是不愿意跟底物說再見！咋辦？

　　面對貼壁性極強的細胞，可進一步使用 含EDTA的胰蛋白酶 來消化細胞，EDTA會抓住細胞表面未洗凈的鈣、鎂離子，降低黏附蛋白活性使細胞不會彼此粘黏，同時讓胰蛋白酶在不受鈣、鎂離子干擾下發(fā)揮最大作用剪切胞外基質及黏附蛋白，讓細胞順利脫離培養(yǎng)底物且減少細胞成團現象。

細胞消化小技巧

不一定要一次把所有細胞都要消化下來！

　　晃動培養(yǎng)盤并在顯微鏡下用肉眼觀察，只要70~80%細胞都收縮了或超過適合消化時間，就該終止消化反應，如果細胞量夠即可進行后續(xù)傳代或實驗步驟；如果細胞量不夠，則可視情況用不含鈣、鎂離子的平衡鹽溶液清洗仍貼壁的細胞，再進行一次消化反應。

▲ 消化不下來的細胞（黃）請視情況決定是否再消化一次。

不一定要吹打成完全單細胞懸液！

　　一般細胞脫離培養(yǎng)底物、并經過5~10次輕柔吹打后，會在細胞懸液里形成小規(guī)模聚集(約5~10顆細胞)，所以不需要過度延長消化時間想讓細胞完全分離成單細胞懸液。

消化效果不佳，先提升消化液濃度、再加長作用時間！

　　當你選定了一種消化方式 (物理機械法除外)，發(fā)現效果不佳，首先應考慮提高EDTA或胰酶濃度，效果再不佳才加長消化的作用時間，避免細胞長時間浸泡在消化液中造成的細胞膜損傷。

（一般消化液使用：0.02%~0.04% EDTA作用5-20分鐘；0.2~0.5% 胰蛋白酶作用1~5分鐘）
 

結語

 細胞消化 ，是一個看似很簡單，但是有很多技術含量的步驟。消化好壞、是否污染、有無受傷，都在這短短的五六分鐘里決定。

當我們已經可以順利操作細胞培養(yǎng)實驗，接下來要思考的，就是如何讓細胞長得更健康、更均一、做出來的實驗才會更完美。

祝各位的細胞都顆顆透亮、粒粒分明、活力旺盛！

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