肺癌是中國乃至全球最惡性的腫瘤，在各類腫瘤中的發病率及死亡率一直位居第一，成為威脅人類健康的頭號殺手。同時，肺癌也是臨床研究的重要領域，每年與肺癌相關的SCI論文超過萬篇，其中肺癌動物模型已逐漸成為其機制研究及藥物研發必不可少的工具。本期有幸邀請到了有多年經驗的博士師兄，為大家介紹在研究中經常用到的幾種肺癌動物模型。

肺癌發病率和死亡率

2017年2月4日，國家癌癥中心公布的最新數字顯示，在中國惡性腫瘤發病率為270.59/10萬，死亡率為163.83/10萬，其中肺癌為發病率、死亡率雙率第一，每年約59.1萬人死于肺癌，其中男性居多，約40.2萬。

同樣在美國，2017年1月5日，美國癌癥協會的統計表明，如下表所示，在美國男性和女性中肺癌的致死率依然是位居第一［1］。

圖1. 美國癌癥發病率和死亡率

肺癌細胞的分類

根據肺癌的分化程度和形態特征，目前肺癌主要分為兩大類，即非小細胞肺癌和小細胞肺癌，前者主要包括腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌［2］。

常見的肺癌模型

肺癌模型主要分為CDTX肺癌細胞移植模型（皮下移植模型和原位移植模型），PDTX（人源腫瘤組織異種移植模型）和基因修飾的肺癌模型，下面依次介紹。

一、CDTX肺癌細胞移植模型

肺癌模型中，根據接種部位主要分為皮下和原位移植模型，在這類模型中需要選擇正確的肺癌細胞株，可以參考上表中肺癌細胞分類，并根據實驗目的選擇正確的荷瘤模型，如皮下荷瘤主要用于單獨研究腫瘤生長情況。

1. 皮下荷瘤

定義：根據研究的肺癌類型及基因突變情況，選取狀態好的腫瘤細胞移植于小鼠皮下。例如，我們研究KRAS突變的肺癌，通常選取KRAS突變的A549細胞，細胞量為1x10⁶－3x10⁶/只。具體的操作視頻和分組請參考往期內容（3.8 移植性腫瘤模型的建立之皮下荷瘤），此處不再贅述。

2. 原位荷瘤

定義：將腫瘤細胞通過注射等方式移植到模式動物肺部構建的動物模型。

模型優點：與皮下荷瘤模型相比，能更好反映腫瘤在人體內的一個發生發展及轉移過程。

實驗操作方法：

1. 細胞系選擇及準備工作

   為了便于觀察肺癌細胞在體內生長情況，選用帶熒光素酶（Luciferase）標簽的A549細胞，取對數生長期的A549-Luc（10⁶/只）用胰酶消化收集，1×PBS洗兩次，用PBS重懸后與生長因子減少的Matrigel基質膠按1:1的比例混合，每只老鼠注射100µl含1×10⁶個細胞的混合懸液；

2. 小鼠的準備工作

   選取6-8周齡的Balb/c無胸腺裸鼠，置于超凈工作臺中麻醉，裸鼠由興奮狀態轉為麻醉狀態后將其以右側臥位固定，胸腔表面用酒精消毒。

3. 切口位置的選取，確定肺部位置

   確定位置：位于小鼠左側肋弓下緣以上約1cm處（第四、五肋弓之間），這一部位有兩條縱向較粗的血管，肺部位于這兩條血管之間（視頻中用黑色marker筆標注位置）；

   露出肺部：先將表皮剪一約5mm的小口，沿此小口逐步剪開下層皮下及肌肉組織，隔著胸膜可以看到粉色的肺部，肺部會隨著小鼠的呼吸收縮和擴張。

4. 腫瘤細胞注射

   取混勻的100µl的細胞懸液，沿著切口對準小鼠的左肺緩慢注射，進針深度約為3mm，注射結束后停針5s，左右旋轉慢速出針。

5. 小鼠傷口縫合

   將剪開的小鼠表皮進行縫合，將小鼠以右側臥位（使傷口朝上）置于37℃恒溫加熱板上直至小鼠蘇醒，放回原籠中繼續飼養，4-6天傷口即可愈合。

視頻：

https://v.qq.com/x/page/y0519t9zogt.html

注意事項：

1. 為什么使用Matrigel？

如果腫瘤細胞僅用PBS重懸便注射到小鼠肺部，細胞可能隨肺部氣管快速擴散，造成氣管堵塞導致小鼠死亡，使用Matrigel與細胞混合后進行實驗便可降低小鼠死亡風險。

2. 如何避免出血？

操作過程中要避開較粗的血管，以免流血影響后續實驗操作以及肺部的觀察；并且最好選用胰島素注射器，由于注射器針頭扎入肺部有可能損傷肺部大血管，很容易造成小鼠的死亡，因此注射器最好選用針頭較細的胰島素注射器。

3. 注意整個操作過程及手術器械要保持無菌，以免小鼠感染［3］。

后續分組和試驗分析

分組時間：一般原位注射一周后，裸鼠肺癌原位模型建成，進行分組（n=10）；

如何分組：依據裸鼠體重腹腔注射相應劑量的D-luciferin (Xenogen) 熒光底物（150 mg/kg），將裸鼠放置于麻醉箱中通以2.5%異氟烷/氧，待裸鼠麻醉后轉入IVIS廂室中，使其腹面朝下并持續通以麻醉氣體，注射底物10min后，進行熒光成像，測量各裸鼠肺部初始熒光值，依據熒光值的大小平均分組。隨后可進行給藥等實驗，定期進行熒光檢測。

人道終點：動物倫理學規定，小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%，平均腫瘤直徑不超過20mm，并且如果出現潰爛，并且嚴重轉移，造成感染或壞死時，應該中止實驗且對動物施行安樂死。

圖2. 肺部原位注射的熒光圖和肺部白光圖[4]

二、PDTX（人源腫瘤組織異種移植模型）

定義：將病人肺癌組織移植到小鼠皮下等部位，主要用于抑制腫瘤生長（細胞增殖）的藥物的篩選檢測，在近年該模型越來越受重視。

模型優點：因為取自病人的腫瘤組織，在組織形態和遺傳特征等方面均與人類腫瘤相同，故這種模型可以更貼近人類腫瘤的生物學特性。

實驗操作方法：

1）處理新鮮肺癌組織：在無菌條件下的冰上對新鮮離體的肺癌腫瘤組織，剔除包膜及壞死組織，切成約15mm³（2mm×2mm×3mm）的小塊；

2）首次接種小鼠：將切好的組織碎片用鑷子填入定制的套管針尖端內，注射到5-6周NOD/SCID重癥聯合免疫缺陷小鼠背部皮下，每只老鼠背部可以接種1-2個位點，每例腫瘤接種2-3只小鼠，此接種過程須在腫瘤標本離體后2h之內完成，為提高成瘤率腫瘤塊也可混合10% Matrigel進行荷瘤；

3）再次傳代：當裸鼠皮下腫瘤生長至1000 mm³左右，表示移植成功，對其處于對數增長期的原代（F1代）皮下移植小鼠模型進行傳代。

1. 剝離皮下腫瘤，部分組織速凍至液氮備用或經4%多聚甲醛固定后石蠟包埋；

2. 另一部分組織按照上述接種步驟，移植到4-5只裸鼠皮下，建立第二代移植小鼠模型（F2代）；

3. 按照此流程，在裸鼠體內連續傳代3代后，移植瘤的生長速度開始穩定，可進行體內動物模型實驗。

后續試驗分析：

待皮下腫瘤組織長到一定體積，進行分組（n=10），保證最終可獲得6個以上有效數據。

不同處理組的肺癌的PDTX模型［4］

三、基因修飾模型

定義：主要是利用基因編輯技術如CRISPR/Cas9進行敲除或插入特定基因，從而誘發動物產生腫瘤的模型。肺癌基因修飾模型主要是KRAS突變誘導肺癌等產生，KRAS突變同時P53缺失會加速腫瘤的發生發展。

模型優點：主要用于腫瘤發生發展過程及作用機制的研究；同時原癌基因的頻發突變是腫瘤產生的重要原因之一，因此靶向這部分原癌基因的抗腫瘤藥物篩選是一個重要方向。

構建方法：可以參考我們往期基因編輯小鼠構建過程（包括KO,KI,CKO小鼠的構建等）

舉例：Lox-STOP-Lox-Kras^G12D Conditional Mouse Model

Ras在人類腫瘤頻發突變，K-ras的激活突變是肺部腫瘤產生的原因之一。在k-ras locus上敲入了Lox-Stop-Lox-Kras^G12D，通過小鼠鼻腔注入Ad-Cre重組腺病毒，誘導肺中的K-ras^G12D表達，從而誘發肺癌［5］。

應用：由于其產生的機制及組織形態和遺傳特征等方面均與人類K-ras突變腫瘤相似，因此該模型能夠很好的評價針對K-ras突變的抗腫瘤藥物活性［4］。

準確的肺癌動物模型至關重要，它是獲得正確實驗數據和發表文章的重要前提，本期我們根據多年的經驗，為大家總結了3種常見的肺癌模型。隨后，我們會繼續介紹其他腫瘤模型的構建，所以做其他腫瘤方向的童鞋不要著急，后期內容會越來越精彩。如果您覺得我們的內容還不錯，快快點擊上方藍字關注吧！

參考文獻

［1］Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 2017 Jan;67(1):7-30.

［2］Lung Carcinoma: Tumors of the Lungs. Merck Manual Professional Edition, Online edition. [2007-08-15].

［3］Wang YW, Wang XW, Wei JM, et al. Establishment of NSCLC in situ metas- tasis model using GFP/A549 cells. J Shandong Univer (Health Sciences), 2006, 44(7): 698-702. 

［4］Wang J, Hu K, Guo J, et al. Suppression of KRas-mutant cancer through the combined inhibition of KRAS with PLK1 and ROCK[J]. Nature Communications,2016: 11363-11363.

［5］Michel DuPage, Alison L Dooley & Tyler Jack. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase .Nat Protoc. 2009;4(7):1064-72.