♦ 前言 ♦

1）腸道外部的膜、血管和脂肪，盡量去除干凈，否則后續得到的分餾會有很多雜細胞污染；
2）用注射器往腸腔內注入PBS，沖洗掉小腸內容物，可以減少后續洗滌時間；
3）用無菌的載玻片刮去小腸內絨毛組織，盡量去除干凈，可以減少雜細胞的產生，另外可以有助于小腸組織的消化，得到更多的小腸隱窩；
4）小腸隱窩消化液用5 mM的EDTA，注意EDTA是否有析出，如析出太多會影響終濃度，有必要更換新的EDTA；
5）因分離小腸隱窩需要時間較久，建議整個操作在低溫進行，離心機調至4℃，PBS放冰上。試用移液器前用冷的PBS潤洗移液器槍頭；
6）EDTA消化后，小腸組織會變松散，在外界機械力作用下，小腸隱窩會從組織中分離出來，可以重復幾次通過外界機械力作用得到不同的分餾組分，可以挑選隱窩含量較高，雜細胞較少的分餾組分種板培養；
7）得到分餾組分后進行隱窩計數，用完全培養基重懸隱窩至8~20個/uL，加入等體積基質膠混合，該過程一定要在冰上操作，混合過程切勿產生氣泡，否則影響后續觀察以及隱窩培養狀態，混勻過程可以調小量程，吸取的液體不要全部吹出；
8）購買的基質膠在冰上融化后分裝凍存，操作過程中基質膠一定要放在冰上，未用完的液體狀基質膠可以凍存，若凝固后請棄去。
9）基質膠種板前需要將培養板放入培養箱溫浴30min，拿出培養板后盡快種板，以便形成更好的基質膠圓頂結構。

1）在成熟類器官的24孔板中，每孔加入約1000基礎培養基，用1 mL槍頭吹打板底的基質膠，直到基質膠全部打碎，收集每個孔中的懸液置于15 mL離心管中；
2）將全部打碎的基質膠懸液冰上放置5～10 min；可用1 mL大槍頭繼續吹打懸液，此過程避免產生氣泡（調制量程到700 μL可避免氣泡產生），可取適量的懸液觀察，直至看不到大塊的類器官團塊為止；
注：此過程也可將全部打碎的基質膠懸液吸入胰島素注射器內，再將懸液通過胰島素注射器針頭打出，通過機械力將類器官團塊分離。

1）將需要凍存的類器官冰上放置5～10 min；
2）收集類器官，步驟同之前傳代收集步驟一致；
3）離心后棄上清，用800 μL的凍存培養液重懸，將懸液移至凍存管中，放入凍存盒中于-80 ℃冰箱中保存24 h，如需長久保存，則24 h后轉移至液氮罐保存。

復蘇準備：37 ℃水浴箱
從液氮中取出凍存管后，立即放入37 ℃水浴中，使之迅速融解。等到凍存管中僅存一小片冰室，迅速將細胞轉移到含9 mL冷的基礎培養基中(先將之置于15 mL離心管中，放于冰上)。200 g 室溫離心5 min，棄去上清，加入適量類器官培基重懸后與基質膠混合種板，待基質膠凝固后加入類器官培養基，將培養板放入培養箱。