細胞灌流培養是蛋白藥物連續流生產工藝的重要一環，而高效、低消耗的培養基則是細胞灌流培養工藝成敗的關鍵因素。在fed-batch工藝占主導的今天，市面上缺乏灌流專用的平臺培養基。生物制藥企業在探索灌流工藝時，往往只能使用fed-batch基礎培養基(或混合少量補料培養基)來作為灌流培養基使用，這些培養基沒有經過專門的灌流營養優化，往往細胞密度和產量不會太高，而且灌流體積比較大，增加生產成本。

本文通過對EX-CELL^® Advanced™ HD Perfusion Medium的產品開發過程進行案例分析，為生物制藥企業的平臺化灌流培養基開發工作提供思路借鑒。

最早的灌流培養基原型是利用默克CHO細胞基礎培養庫（Basal media diversity panel）來生成。我們將庫中不同培養基原型，進行DOE混料設計，生成多個新的混料配方（Mix）平行培養進行對比，并采集相關培養數據，以便進一步優化時進行MVA分析。根據試驗結果，從中初步確定出兩種最適灌流的混料培養基原型Mix G1 和 Mix P1；將此二種原型經過與多種富營養灌流培養基（basal medium enriched with Feed）反復進行反應器工藝平行對比，最終決定將混料培養基Mix P1作為灌流原型來進一步進行營養優化。

圖1 整體優化流程圖

 
通過對上一輪實驗數據的MVA分析，我們從中找出對灌流工藝關鍵參數有顯著影響的營養成分共計11種。然后，采用DOE中心組合設計（CCD）的方法，對這11種成分的最佳濃度分別進行確定。（見下圖2 ）

圖2 關鍵組分濃度優化。等高線圖顯示出11種關鍵組分中的兩種（組分4，9）對蛋白產量的影響

 
最終，我們得到11種組分優化到最佳濃度的全新灌流培養基原型。
 
由于氨基酸在灌流細胞生長中的特殊重要性，我們又對這種新原型培養基單獨進行了氨基酸優化：采用上清分析手段，對灌流中，細胞在生長和表達階段的各氨基酸消耗速率分別進行測量，根據測量結果，我們按照20 pL/cell/day 的CSPR的模型來計算，對培養基中的氨基酸組分進一步強化調整（主要是增加了重要氨基酸的濃度）。氨基酸調整之后, 培養基的CSPR在幾個測試的細胞株上均有顯著降低，同時細胞單產（qp）也得以進一步提高。（見下圖3）。

圖3 氨基酸濃度調整后的效果，在測試CHO-S細胞株上，CSPR從60 pL/cell/day降低到37 pL/cell/day，同時qp從原來的最高8.4pcd提高到最高11.7pcd。

接著對調整后原型的氨基酸消耗速率進行重新測試發現：隨著CSPR的降低，細胞的氨基酸消耗速率也較之前發生了變化，降低CSPR，某些氨基酸卻出現了過量現象（見下圖4）。

圖4 在提高氨基酸濃度，降低CSPR之后，單細胞消耗氨基酸的速率也發生了改變（降低）。

 
這表明，培養基中氨基酸濃度及灌流速率等條件的改變，讓細胞內的某些代謝通路發生了變化。所以，我們對部分過量的氨基酸進行了重新再平衡調整。

我們用不同細胞株對調整后的配方進行反應器灌流驗證，以測試其廣譜性。結果顯示，該配方對不同類型細胞株灌流培養均具有優良效果。（見下圖5）

圖5 在40 pL/cell/day的CSPR下灌流超過30天，細胞數維持在50*106 vc/mL，同時單位產量也維持穩定

 
小結：
在灌流培養基的開發過程中，統計學工具是必不可少的。如通過MVA分析定向找出關鍵組分，再通過DOE設計，對關鍵組分濃度進行快速優化，從而提升性能，這是灌流培養基開發的一個重要手段。另外，本案例顯示，氨基酸濃度對灌流效果有相對重要的作用，通過氨基酸濃度的優化，較明顯提升了培養效果。但在初次調整氨基酸濃度后，細胞的氨基酸代謝也隨著出現了一定的變化（如重新測試后發現某些氨基酸有過量現象），說明細胞的氨基酸代謝之間有復雜的關聯，對氨基酸的調整需要進行反復摸索，才可找到最佳的濃度組合。
 
 
默克新一代EX-CELL^® Advanced™ HD Perfusion Medium訂購信息：


如需咨詢產品信息，請點擊此處（https://app.askform.cn/18375650001.aspx）。
 
如您正在研發新冠病毒藥物，請點擊此處（https://app.askform.cn/18374910001.aspx）填寫問卷調查。我們會第一時間為您提供新冠藥物開發所涉及的產品技術與服務組合，及全球專家的優先支持。幫助您快速到達臨床，取得戰“疫”的勝利。
新冠病毒藥物研發默克聯系人：
史秋明博士 客戶技術應用總監
聯系方式：miles.shi@merckgroup.com
我們也將給您配備一對一的技術咨詢專家。