PRIMO冷凍電鏡在標準化細胞觀察的應用
（一） 總述：
冷凍電鏡（ Cryo-EM）是觀察細胞內分子構造的有力工具。然而，用冷凍電鏡觀察細胞
樣本是具有挑戰性的，細胞經常粘附在金屬網格框架上，影響成像質量。
用法國 Alveole 公司的 PRIMO“定制化細胞微環境制備系統”，其無掩模、非接觸式的
微圖案（ micropatterning）功能能為您的 TEM（ Transmission Electron Microscopy，透
射電子顯微術）和 cryo-ET（ Cryogenic Electron Tomography，冷凍電子掃描斷層成像術）
實驗提供更好的細胞樣本【 1】 ：
（ 1） 自動化細胞定位： 在電鏡網格（ EM grids）的網眼（ mesh）中央進行精準的自動化細
胞定位；
（ 2） 標準化細胞模型： 微圖案化設計可重復，可進行力學生物學研究；
（ 3） 電鏡網格表面無損傷： 微圖案化為非接觸式 UV 投射，可保護電鏡網格的表面完整性。
（二） 自動化細胞定位
PRIMO 的 LEONARDO 軟件能檢測到電鏡網格的網眼，并自動在網眼的中央用 PRIMO 蝕刻
出對齊的微圖案。這樣就能保證細胞都定位在網眼的正中央，有利于電鏡的成像觀察。
冷凍電鏡（ Cryo-EM）是觀察細胞內分子構造的有力工具。然而，用冷凍電鏡觀察細胞
樣本是具有挑戰性的，細胞經常粘附在金屬網格框架上，影響成像質量。
用法國 Alveole 公司的 PRIMO“定制化細胞微環境制備系統”，其無掩模、非接觸式的
微圖案（ micropatterning）功能能為您的 TEM（ Transmission Electron Microscopy，透
射電子顯微術）和 cryo-ET（ Cryogenic Electron Tomography，冷凍電子掃描斷層成像術）
實驗提供更好的細胞樣本【 1】 ：
（ 1） 自動化細胞定位： 在電鏡網格（ EM grids）的網眼（ mesh）中央進行精準的自動化細
胞定位；
（ 2） 標準化細胞模型： 微圖案化設計可重復，可進行力學生物學研究；
（ 3） 電鏡網格表面無損傷： 微圖案化為非接觸式 UV 投射，可保護電鏡網格的表面完整性。
（二） 自動化細胞定位
PRIMO 的 LEONARDO 軟件能檢測到電鏡網格的網眼，并自動在網眼的中央用 PRIMO 蝕刻
出對齊的微圖案。這樣就能保證細胞都定位在網眼的正中央，有利于電鏡的成像觀察。
圖 1. 細胞在傳統電鏡網格中的定位和在 PRIMO 處理過的網格中的定位的對比【 2】：
（ a 圖）： Hela 細胞在標準金網格（覆蓋 SiO2 R2/1 多孔膜）中的冷凍掃描電鏡（ Cryo-SEM ）
圖像。可見大多數細胞都粘附在網格的框架上，只有少數細胞有較好的定位（箭頭表示），
準備制作 FIB-lamellae（ focused ion beam-lamellae，聚焦離子束-晶片）。
圖像。可見大多數細胞都粘附在網格的框架上，只有少數細胞有較好的定位（箭頭表示），
準備制作 FIB-lamellae（ focused ion beam-lamellae，聚焦離子束-晶片）。
（ b 圖）：在金網格的網眼中加上一個直徑 20µm 的纖維連接蛋白組成的微圖案。拍攝 Hela
細胞在這個微圖案化的網格中的圖像，可見所有細胞都定位在網眼的正中央。白色的雜質為
冰晶的污染物。
（ c-d 圖）：局部放大圖： Hela 細胞，用 GFP 標記β -微管蛋白（藍綠色）和用 mCherry 標
冰晶的污染物。
（ c-d 圖）：局部放大圖： Hela 細胞，用 GFP 標記β -微管蛋白（藍綠色）和用 mCherry 標
記組蛋白（品紅色），分別種植在標準網格中（ c 圖）和微圖案化的網格中（ d 圖）。可見
在微圖案化的網格中（ d 圖），細胞都定位在網眼的正中央。比例尺： 20µm。
在微圖案化的網格中（ d 圖），細胞都定位在網眼的正中央。比例尺： 20µm。
圖 2. PRIMO 對網格中央微圖案化后，可保證細胞的定位適合進行 FIB milling 和 cyro-ET
成像【 2】：
（ e 圖）：對（圖 1， b 圖）中的細胞進行 FIB 淺角度成像，黃色長方體表示準備 milling
的微圖案。
（ f 圖）：由（ e 圖）中的細胞形成的最終的晶片（ FIB-lamellae）。
（ g 圖）：是（ e 圖）中細胞的核周圍的斷層掃描切片（ tomographic slice）， 6.8nm 厚。
成像【 2】：
（ e 圖）：對（圖 1， b 圖）中的細胞進行 FIB 淺角度成像，黃色長方體表示準備 milling
的微圖案。
（ f 圖）：由（ e 圖）中的細胞形成的最終的晶片（ FIB-lamellae）。
（ g 圖）：是（ e 圖）中細胞的核周圍的斷層掃描切片（ tomographic slice）， 6.8nm 厚。
顯示細胞核周圍的結構， NPC：核孔復合物； MT：微管。
（三） 標準化細胞模型
微圖案化已被證明是一個控制體外細胞粘附的有效方法。因此， 此技術被廣泛用于對細
胞形態和細胞內部組織進行標準化（使之直接與外部的粘附條件相關聯）。
因為 PRIMO 的微圖案化操作可以在電鏡網格的網眼中自動加上排列一致的微圖案，
PRIMO 已成為進行均質化和標準化冷凍電鏡（ cryo-ET）實驗的工具。
進一步而言，在冷凍電鏡觀察細胞的實驗中使用 PRIMO 進行微圖案化，有助于精準地針
對特定的細胞內部元素進行成像觀察，而用其他成像方法很難做到【 1】。
微圖案化已被證明是一個控制體外細胞粘附的有效方法。因此， 此技術被廣泛用于對細
胞形態和細胞內部組織進行標準化（使之直接與外部的粘附條件相關聯）。
因為 PRIMO 的微圖案化操作可以在電鏡網格的網眼中自動加上排列一致的微圖案，
PRIMO 已成為進行均質化和標準化冷凍電鏡（ cryo-ET）實驗的工具。
進一步而言，在冷凍電鏡觀察細胞的實驗中使用 PRIMO 進行微圖案化，有助于精準地針
對特定的細胞內部元素進行成像觀察，而用其他成像方法很難做到【 1】。
圖 3. 微圖案化可控制細胞的形態和細胞骨架結構【 2】：
（ a 圖）： RPE1 LifeAct-GFP 細胞內的肌動蛋白微絲組織的活細胞共聚焦顯微圖像，該細胞
生長在 PRIMO 制造的微圖案上（金網眼， SiO2 膜 R1/4）。黃色箭頭：肌動蛋白應力纖維（ actin
stress fibers）。藍色箭頭：由 putative bundles 組成的肌動蛋白環（ actin rings）。
（ h-i 圖）：一個生長在十字弓形狀的微圖案（黃色）上的細胞的掃描電鏡（ SEM）圖，微
圖案由 PRIMO 制造。黃色長方體表示準備 milling 的微圖案。
P1 和 P2 方塊：圖 4 中（ j 圖）和（ k 圖）的斷層掃描切片（ tomographic slice）的位置。
圖 4. （ j-k 圖）：冷凍電鏡圖像：分別是（圖 3， h 圖）中 P1 和 P2 兩個位置的斷層掃描切
片。
根據十字弓形狀的 RPE1 細胞的肌動蛋白圖譜（ actin map），在預期的位置發現了大致等同
于肌動蛋白橫向弧（ actin transverse arcs）（與細胞邊緣平行但有一定距離）的肌動蛋
白束（ actin bundles）和在（圖 3， a 圖）中顯示的內部應力纖維（ internal stress fibers）
【 2】。
（四） 電鏡網格表面無損傷
因為 PRIMO 是無掩模和非接觸式光刻系統，它可以將您要的微圖案用 UV 光投射到電鏡
網格的表面，而不會損傷網格的完整性。
圖 5. 用 PRIMO 系統對電鏡網格進行無掩模的光照圖案化（ photopatterning）操作【 3】：
在金電鏡網格上加上一層多孔碳膜，在多孔碳膜上包裹一層防污涂層（ PLL-g-PEG，聚 L 賴
氨酸-g-聚乙二醇），阻礙蛋白質粘附。加入 PLPP 光引發劑，通過 PRIMO 的非接觸式、無掩
模的光刻技術，用 UV 光將圖案投射到碳膜上，防污涂層被降解，蝕刻出微圖案， ECM 蛋白
可粘附在蝕刻出的微圖案上，細胞再粘附在蛋白上。整個過程對電鏡網格無損傷。
圖 6. 左側（ a 圖）：用 PRIMO 無掩模光照圖案法（ photopatterning）得到的，在多孔碳電
鏡網格中的 ECM 蛋白微圖案。電鏡網格為 200 目的金格柵條，比例尺為 50µm。
右側（ A-I 圖）：上皮 PtK1 細胞，被限制在電鏡網格中的羅丹明-纖維連接蛋白（紅色）組
成的微圖案上，該微圖案由 PRIMO 無掩模光照圖案法得到。比例尺為 10µm。【 3】
（五） 什么是 PRIMO？
5.1 PRIMO 的原理
法國 Alveole PRIMO “ 定制化細胞微環境制備系統” 是創新性定制細胞模型的工具，
能在微米級別的尺度下，以具有超高靈活度和再現性的生物工程手段實現體外微環境的定
制，同時可對其機械力學和生化特性進行設計微調。
圖 7. 左圖：選擇電腦中任意一張圖案，在 LEONARDO 軟件作用下，用 PRIMO 進行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數倒置顯微鏡兼容。右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（ Digital Micromirror Device），即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態，控制投射在細胞
基質上的 UV 光的照射強度、照射時間和照射區域，按照圖案進行靈活蝕刻【 4】。
PRIMO 的微圖案法（ Micropatterning）的實驗原理可參考： 生物建模的黑科技——快
捷精準的“定制化細胞微環境制備系統”（上）。
5.2 PRIMO 的主要特點和優勢【 4】：
⚫ 無掩模： 非接觸式、無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm），可靈活控制 UV 的強度、照
射時間、區域；
⚫ 自動化： 全自動快速定制，可針對實驗條件進行快速優化；
⚫ 高靈活性： 可按照任意圖案去構建您的基質和/或使其功能化，不限圖案的大小和復雜
程度，生成不同的細胞模型；
⚫ 多樣性/兼容性： 適用于常規的細胞培養基質，基質可為平面或有微結構，可硬可軟，
如：玻璃蓋玻片、塑料培養皿、聚二甲基硅氧烷（ PDMS）、聚苯乙烯、水凝膠（ PEG 丙
烯酸酯、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂、基質膠）、光刻膠，等；
⚫ 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體，等；
⚫ 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（ 500× 300µm ， 20 倍物鏡）；
⚫ 多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次，粘附不同密度層次的蛋白；
⚫ 多種蛋白： 可應用 3 種不同蛋白（根據實驗需求）；
⚫ 自動對齊： 自動進行檢測和圖案定位，可自動對齊于微結構或者微圖案上；
⚫ 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡，僅需 30s。
5.3 PRIMO 的應用領域
PRIMO 強大的生物建模能力和對細胞微環境的控制，可以為多種生物學實驗帶來全新
的、突破性視角，可用于研究細胞遷移/趨觸性、細胞黏附、 2D/3D 細胞標準化培養、細胞
球培養、生物力學、組織工程、微流體芯片，等多個領域【 4】 。
（六） 附錄
更多資訊，請聯系：森西科技有限公司，電話： 010-61666616，熱線: 400-687-6366，
郵箱： info@sinsitech.com，網址： www.senxikeji.com。掃描以下二維碼，關注微信公眾
號，獲得更多信息：
（ a 圖）： RPE1 LifeAct-GFP 細胞內的肌動蛋白微絲組織的活細胞共聚焦顯微圖像，該細胞
生長在 PRIMO 制造的微圖案上（金網眼， SiO2 膜 R1/4）。黃色箭頭：肌動蛋白應力纖維（ actin
stress fibers）。藍色箭頭：由 putative bundles 組成的肌動蛋白環（ actin rings）。
（ h-i 圖）：一個生長在十字弓形狀的微圖案（黃色）上的細胞的掃描電鏡（ SEM）圖，微
圖案由 PRIMO 制造。黃色長方體表示準備 milling 的微圖案。
P1 和 P2 方塊：圖 4 中（ j 圖）和（ k 圖）的斷層掃描切片（ tomographic slice）的位置。
圖 4. （ j-k 圖）：冷凍電鏡圖像：分別是（圖 3， h 圖）中 P1 和 P2 兩個位置的斷層掃描切
片。
根據十字弓形狀的 RPE1 細胞的肌動蛋白圖譜（ actin map），在預期的位置發現了大致等同
于肌動蛋白橫向弧（ actin transverse arcs）（與細胞邊緣平行但有一定距離）的肌動蛋
白束（ actin bundles）和在（圖 3， a 圖）中顯示的內部應力纖維（ internal stress fibers）
【 2】。
（四） 電鏡網格表面無損傷
因為 PRIMO 是無掩模和非接觸式光刻系統，它可以將您要的微圖案用 UV 光投射到電鏡
網格的表面，而不會損傷網格的完整性。
圖 5. 用 PRIMO 系統對電鏡網格進行無掩模的光照圖案化（ photopatterning）操作【 3】：
在金電鏡網格上加上一層多孔碳膜，在多孔碳膜上包裹一層防污涂層（ PLL-g-PEG，聚 L 賴
氨酸-g-聚乙二醇），阻礙蛋白質粘附。加入 PLPP 光引發劑，通過 PRIMO 的非接觸式、無掩
模的光刻技術，用 UV 光將圖案投射到碳膜上，防污涂層被降解，蝕刻出微圖案， ECM 蛋白
可粘附在蝕刻出的微圖案上，細胞再粘附在蛋白上。整個過程對電鏡網格無損傷。
圖 6. 左側（ a 圖）：用 PRIMO 無掩模光照圖案法（ photopatterning）得到的，在多孔碳電
鏡網格中的 ECM 蛋白微圖案。電鏡網格為 200 目的金格柵條，比例尺為 50µm。
右側（ A-I 圖）：上皮 PtK1 細胞，被限制在電鏡網格中的羅丹明-纖維連接蛋白（紅色）組
成的微圖案上，該微圖案由 PRIMO 無掩模光照圖案法得到。比例尺為 10µm。【 3】
（五） 什么是 PRIMO？
5.1 PRIMO 的原理
法國 Alveole PRIMO “ 定制化細胞微環境制備系統” 是創新性定制細胞模型的工具，
能在微米級別的尺度下，以具有超高靈活度和再現性的生物工程手段實現體外微環境的定
制，同時可對其機械力學和生化特性進行設計微調。
圖 7. 左圖：選擇電腦中任意一張圖案，在 LEONARDO 軟件作用下，用 PRIMO 進行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數倒置顯微鏡兼容。右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（ Digital Micromirror Device），即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態，控制投射在細胞
基質上的 UV 光的照射強度、照射時間和照射區域，按照圖案進行靈活蝕刻【 4】。
PRIMO 的微圖案法（ Micropatterning）的實驗原理可參考： 生物建模的黑科技——快
捷精準的“定制化細胞微環境制備系統”（上）。
5.2 PRIMO 的主要特點和優勢【 4】：
⚫ 無掩模： 非接觸式、無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm），可靈活控制 UV 的強度、照
射時間、區域；
⚫ 自動化： 全自動快速定制，可針對實驗條件進行快速優化；
⚫ 高靈活性： 可按照任意圖案去構建您的基質和/或使其功能化，不限圖案的大小和復雜
程度，生成不同的細胞模型；
⚫ 多樣性/兼容性： 適用于常規的細胞培養基質，基質可為平面或有微結構，可硬可軟，
如：玻璃蓋玻片、塑料培養皿、聚二甲基硅氧烷（ PDMS）、聚苯乙烯、水凝膠（ PEG 丙
烯酸酯、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂、基質膠）、光刻膠，等；
⚫ 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體，等；
⚫ 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（ 500× 300µm ， 20 倍物鏡）；
⚫ 多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次，粘附不同密度層次的蛋白；
⚫ 多種蛋白： 可應用 3 種不同蛋白（根據實驗需求）；
⚫ 自動對齊： 自動進行檢測和圖案定位，可自動對齊于微結構或者微圖案上；
⚫ 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡，僅需 30s。
5.3 PRIMO 的應用領域
PRIMO 強大的生物建模能力和對細胞微環境的控制，可以為多種生物學實驗帶來全新
的、突破性視角，可用于研究細胞遷移/趨觸性、細胞黏附、 2D/3D 細胞標準化培養、細胞
球培養、生物力學、組織工程、微流體芯片，等多個領域【 4】 。
（六） 附錄
更多資訊，請聯系：森西科技有限公司，電話： 010-61666616，熱線: 400-687-6366，
郵箱： info@sinsitech.com，網址： www.senxikeji.com。掃描以下二維碼，關注微信公眾
號，獲得更多信息：
參考文獻：
【 1】 Alveole 的官網：
https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
【 2】 M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by
photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 2019,
https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5.
【 3】 L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell
cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and
Microengineering, 29 (2019) 115018 (9pp),https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a
【 4】 Alveole 的官網： https://www.alveolelab.com/
【 1】 Alveole 的官網：
https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
【 2】 M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by
photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 2019,
https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5.
【 3】 L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell
cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and
Microengineering, 29 (2019) 115018 (9pp),https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a
【 4】 Alveole 的官網： https://www.alveolelab.com/
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