賽業神經科學云課堂：尋找造成帕金森病的兇手
賽業神經科學云課堂，不定期更新神經領域相關干貨，同時歡迎大家提出自己感興趣的神經方面的問題，我們將篩選大家感興趣的問題，在本欄目后面的內容為大家做出詳細解答～
4.11日是世界帕金森病日，為了讓大家深入了解這個疾病，我們做了兩期專題內容，上期給大家介紹了PD的癥狀、流行病學、診斷和主要的治療方法，錯過的同學可以戳這里回顧。這期內容，我們將帶大家尋找造成帕金森病的兇手，重現案發過程。
01 導致PD的重要嫌疑人及案發現場
如果我們把帕金森病當作一起案件的話，那么案發地就是中腦黑質區（Substantia nigra，SN）；受害人就是多巴胺神經元，現在的目標就是找到“兇手”。
經過調查，一種神經細胞內聚集的蛋白質—路易小體（Lewy Body），多次出現在案發現場，而路易小體是由α-synuclein（α突觸核蛋白）聚集而成的，所以我們是否可以將α突觸核蛋白作為真兇呢？答案是不能，只能當成重要嫌疑人或者是犯罪成員之一，因為在部分PD病患的SN中，α突觸核蛋白是有不在場證明的。
剛開始，案件就陷入了僵局。那么我們先來看看案發現場黑質區域，由于該區域中有富含神經黑色素（neuromelanin）的神經元聚集，顏色較深。該區域隸屬于基地神經節（basal ganglia，BG）的一部分，而基地神經節又是中腦（Middle Brain）的子區域，無論是從人類還是嚙齒類動物的大腦角度看，這個區域的體積都很小（注意，圖中綠色部分代表的是整個中腦，而黑質只是其中箭頭所指虛線附近部分），但對于動物的運動卻至關重要。這是因為其中有大量的多巴胺神經元聚集，多巴胺的功能不用多說，除了是所謂的“快樂源泉”以外，也對人類的運動起著調節作用，過多和過少都不是好現象。SN雖然很小，但還是可以分成兩個區域，黑質致密區（Substantia nigra pars compacta，SNc）和黑質網狀區（Substantia nigra pars reticulata，SNr），其中致密區含有大量的多巴胺神經元，也是PD的重災區。SNr區接收并處理BG和其他腦區的輸入信號，SNc中的多巴胺神經元則負責根據SNr提供的信息向紋狀體（striatum）提供多巴胺，進而調控運動。而PD則是因為前文提到的該區域多巴胺神經元死亡而造成的多巴胺分泌不足，導致丘腦參與控制的運動過程發生障礙。
圖1. 中腦黑質是PD的病灶[1-4]
02 案情推測： 帕金森病的發病假說
我們先說一下造成多巴胺神經元死亡的重要嫌疑人“α-synuclein”，該蛋白由4號染色體上的SNCA基因（Synuclein Alpha）編碼而來，在大腦中含量豐富，分布在神經元突觸前膜上。正常情況下，這種蛋白規規矩矩地行使它日常樸實無華的功能（目前一些研究發現該蛋白參與突觸囊泡的釋放，但具體細節仍有待研究）。那么，這個平時沒什么存在感的突觸核蛋白又是怎么走向黑化之路的呢？首先，如果SNCA基因本身存在突變或者過多重復，會導致α-synuclein增多，加劇聚集；接下來，如果負責降解工作的parkin(泛素連接酶)和UCH-L1蛋白發生改變，那么，也會造成α-synuclein的累積；再然后如果HSPs1也發生改變的話，會導致α-synuclein與多巴胺結合，降低多巴胺水平；如果α-synuclein聚合物進一步合體形成路易小體，本身就具有神經毒性，而且抱團之后還能共同抵抗其他機制對其的降解。
除了泛素降解外，自噬作用也是神經元防止α-synuclein聚集的重要手段，LRRK2（和自噬作用有關的蛋白）的突變與家族早發型的PD相關。此外，因為自噬和PD搭上關系的還有Rab1A。ATP酶ATP13A2也是PD相關基因。
和AD一樣，早發型PD遺傳度較高，晚發型PD的遺傳度非常低，但無論如何，咱也可以通過大量測序找到一些犯罪嫌疑人，比如在AD中大放異彩的MAPT就又被拎了出來，但這個需要在額顳葉癡呆并發PD中才有，其實是額顳葉癡呆的特征；另外APOE4也與PD的發病扯上了關系，而且APOE2這個具有AD保護作用的APOE形式也被指控提高了PD的發病率。
雖然在某種程度上，α-synuclein可以和AD中的Aβ進行類比，但其實這二者在PD和AD中的作用還是有很大區別的。首先，Aβ是在胞外聚集的，而α-synuclein是在胞內形成路易小體的，這有點類似于AD發病的幫兇tau；另一方面Aβ聚集可以說是AD的標志，如果沒有淀粉樣沉淀，這種癡呆就不屬于AD，但路易小體只是PD大概率出現的病理特征，并不能作為PD診斷的必要條件。這是因為很多家族性的PD中并沒有路易小體的形成，而家族性的AD中淀粉樣蛋白沉淀則是必須的。
圖2. 帕金森病的發病假說[5]
03 重現案發過程的”工具“—PD動物模型
帕金森病造模的主要目標就是盡量特異性殺死SNc中的多巴胺神經元，減少下游紋狀體能夠接收到的多巴胺。從方式上看主要有化學誘導和基因編輯兩種。
化學誘導PD模型
化學誘導的模型的優點是：有明顯的SNc多巴胺神經與減少和紋狀體多巴胺缺失，部分藥物也能誘導出路易小體；但是化學誘導的PD模型也有明顯的缺點：那就是多巴胺神經元的死亡速度過快，人從多巴胺神經元死亡到PD發病一般都要經歷十幾年以上，而化學誘導的模型幾天內就達到了人幾十年病程形成的死亡的神經元數量，而且這些神經元和多巴胺缺失最嚴重的的模型中，并沒有路易小體的出現。個人認為路易小體的形成絕非一朝一夕之功，需要眾多α-synuclein十幾年甚至幾十年的修煉。
MPTP是最早被應用于建立PD模型的化學毒性物質，但有意思的是MPTP對靈長類和（NHP）小鼠具有很強的毒性，但是對大鼠的毒力卻不是很強。無論是在NHP還是小鼠實驗中，MPTP都能造成嚴重的黑質神經元丟失和紋狀體多巴胺減少，上述損傷是對PD這部分病理表型非常好的模擬。
另一種化學物質就是6-OHDA了，比起MPTP，這玩意兒能用來構建大鼠PD模型，但6-OHDA不能通過血腦屏障，因此大多數情況下需要直接向腦里進行注射。和MPTP一樣，α-synuclein還沒來得及聚集多巴胺神經元就掛了。
長時間使用rotenone可以使大鼠黑質紋狀體多巴胺減少，還能產生多項類似人類PD中的癥狀，長時間使用rotenone還能誘使神經元產生有成為路易小體潛質的初始α突觸核蛋白聚合物。但也有一些研究表示rotenone先前優秀的造模效果無法重復。
下面一個出場的就是著名的除草藥物——百草枯了，作為曾經大范圍應用的農藥，現在已經因為會誘導帕金森而提早退休，但是仍然活躍在科研舞臺。
此外，還有METH（methamphetamine）和MDMA（methylenedioxymethamphetamine）也是用于PD化學建模的物質，應用也比較廣泛。
圖3. 化學誘導PD模型[6]
PD相關基因編輯模型
人類家族性或者散發性PD相關基因的基因編輯動物是另一類值得研究的模型。人們最先想到的是α突觸核蛋白轉基因小鼠，所以對應基因也被叫做Park1（帕金森相關基因No.1）。家族性PD的Park1三個突變（A30P, A53T和E46K）和該基因的拷貝數異常增加（兩倍或三倍）都是PD的罪魁禍首，針對上述PD病因制作的轉基因小鼠已經大量應用于實驗，一些表達人類突變α-synuclein的小鼠紋狀體中多巴胺明顯減少，有的品系有類似路易小體前體的包涵體出現，而且還出現了PD癥狀。不過美中不足的是，幾乎所有針對α突觸核蛋白的小鼠并沒有發生明顯的黑質神經元死亡。之所以沒有把話說死，是因為有研究發現如果用Pitx3啟動子轉入α-synuclein，會發生多巴胺神經元漸進性死亡，但這個結果還需要更多的重復進行驗證。此外，如果用病毒將突變的α突觸核蛋白基因包裝好，注射大鼠或者小鼠的腦中進行過表達，也可以造成PD的病理表型。
前文中已經提到的自噬相關LRRK2是晚發性PD相關基因，但是目前單獨對這個基因進行操作的動物模型很難得到PD的明顯表型。雖然LRRK2敲除小鼠不會產生路易小體，但在一定程度上造成α-synuclein的聚集，有部分品系還能出現運動障礙。遺憾的是，這些模型小鼠能產生路易小體的前體聚合物的沒能出現運動障礙，而具有運動障礙的又沒有路易小體前體產生。但該小鼠仍然在PD信號通路的研究中發揮了重要作用。
PINK1是另一個晚發AD相關基因，但如果在PINK1敲除小鼠的SNc中過表達突觸核蛋白，就會造成該區域的多巴胺神經元大量死亡。另一方面如果直接將PINK1基因直接敲除，會造成紋狀體的多巴胺減少，但不會造成多巴胺神經元死亡。E3連接酶PARKIN在小鼠中敲除后，除了部分小鼠有略微的多巴胺表達下降外，沒有任何改變。不過最近又有一些不同的聲音，經過一些稍微不同的基因編輯方法，有的模型動物的表型出現了一些改進。
DJ-1與早發型PD相關，但大部分經過改造的小鼠無法重現人類中的PD表型，不過在一種C57為背景的DJ-1敲除小鼠中，對它的描述是有明顯的早發SNc區多巴胺神經元丟失，這種改變會隨著年齡的增加而加劇，并會出現輕微的運動缺陷。如果小鼠的表型能夠重復，這個品系也不失為PD研究中值得推廣的模型。ATP13A2則是溶酶體相關的ATP酶，目前針對該基因的研究較少，但也是PD研究的潛力股。
雖然PD遺傳風險相關的基因編輯小鼠整體的PD癥狀較輕，但人類PD的發病前相當長的一段時間內也是沒有表性的，因此這類模型更像是對PD臨床診斷前病患的模擬。因此，這些動物模型對我們的藥物臨床前研究依舊有著重要的意義。至于為什么這些基因編輯動物癥狀較輕，個人想法是小鼠因為壽命太短，沒有充足的時間積累各種病理改變，因而無法產生人類中較嚴重的PD癥狀。
圖4 . PD相關基因編輯模型[6]
總之，目前PD這個案件雖然已經抓到了不少“犯罪嫌疑人”，但由于缺少決定性的證據，至今仍然沒有定案。目前PD動物模型中沒有一款能百分之百完全模擬PD病癥，但它們各有特點，對于推進PD的治療和研究至關重要。化學毒性模型有最明顯的多巴胺神經元凋亡，但非“自然”因素過強，毒性過大，路易小體產生困難；PD相關基因編輯小鼠內在與人的PD最為接近，也為我們提供了很多基因相互作用的信息，但由于物種的差異造成病理表型和行為表型不明顯，而且不同的基因編輯方式和不同的檢測方法也讓實驗結果常常不一致。
好了，關于PD的介紹就到這里，下一次給大家介紹由于霍金和冰桶挑戰而家喻戶曉的罕見病——漸凍癥（ALS）！
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