生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學的研究有著十分重要的意義。 第一代測序儀對電泳分離技術的依賴，使其難以進一步提高分析的速度和并 行化程度，也難以通過微型化降低測序成本。經過不斷的技術開發和改進， 21世紀初，以Roche454技術、illumina公司的GenomeAnalyzer技術和ABI 公司的Solid技術為標記的第二代測序技術誕生了。第二代技術大大降低了測序成本，還大幅度提高了測序速度并保持了高準確性。其中，illumina公司的第一臺測序儀于2006年問世，之后開發出來一系列的測序儀，如 Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、HiseqX等，在準確性、通量、成本和速度方面表現更優秀，而使其成為全球使用量最大的第二代測序儀。

 

       近幾年來，包括人、擬南芥以及水稻等越來越多的基因組被測序，全基因組測序為重要基因的克隆、基因的系統進化和基因組學研究提供了堅實的 平臺。但依然有部分珍貴物種由于樣本較少獲取難度大，或者個體較小獲得 的基因組濃度較低等原因，得到的基因組DNA少(低于50ng)，按照目前現有的文庫定量及測序方法，準確檢測的難度非常大。

 

       測序文庫的定量分析和質量評價對于獲得高質量的核酸測序數據十分關鍵。因為：

 

       1.如果測序文庫拷貝數偏低，將不能獲得足夠的測序數據，導致降低數據產出;

 

       2.如果測序文庫拷貝數過高，將產生低質量的測序數據，甚至會導致測序失敗。

 

       因此，要控制NGS測序儀上測序文庫的載入量，保證測序數據的質量，就需要在測序前對DNA測序文庫進行定量分析。

 

       小艾為您推薦GeneCopeia 萌新產品Illumina 平臺測序文庫定量試劑盒--NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®  。這是一種基于 qPCR 方法對 Illumina 平臺測序文庫進行 DNA 分子數絕對定量分析的試劑盒。它可以對兩端含有 Illumina P5、P7 芯片序列的各種類型 DNA 片段文庫進行高特異性的快速定量，檢測結果靈敏度高，準確度高，重復性好，適用于大多數qPCR儀器。

 

       Illumina 平臺測序文庫定量試劑盒優勢：

 

       靈敏度高—能檢出低至 0.0002 pM 的文庫樣品；

       特異性強—使用抗體修飾法熱啟動 DNA 聚合酶，避免了 PCR 擴增前的非特異性結合；文庫定量引物采用特殊算法設計，不會形成引物二聚體；

       擴增范圍廣—能檢測平均片段長度 1 kb 以內的文庫；

       擴增效率高（E>0.92），實驗重復性好（R2>0.99）。

 

       Illumina 平臺測序文庫定量試劑盒包含以下四種成分：

 

       文庫DNA定量標準品（qPCR DNA standard for Illumina）：經過梯度稀釋的六份十倍比梯度稀釋的雙鏈DNA片段溶液（20 pM-0.0002 pM），經過絕對定量和嚴格質控，用于標準曲線制作；

       文庫定量引物（qPCR primer Mix for Illumina）：含有 Illumina P5，P7 芯片序列并經過優化設計的一對qPCR引物；

       2×qPCR預混液（2× BlazeTaq™ NGS qPCR Mix）：含有性能優化的抗體修飾法DNA聚合酶、qPCR反應緩沖液和SYBR Green染料等qPCR反應所需成分；

       ROX參比染料（ROX Reference Dye）。

 

       Illumina 平臺測序文庫定量試劑盒性能數據展示

 

       圖1. DNA標準品擴增曲線與熔解曲線。使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®檢測6個10倍梯度稀釋的文庫DNA定量標準品，每個標準品平行重復2次。結果顯示，試劑盒具有靈敏度高、特異性強、重復性好的特性。

 

 

       圖2. 擴增產物電泳圖。使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®擴增文庫DNA標準品得到的qPCR產物，電泳分析無非特異擴增現象。

       圖3.兩款試劑盒中標準品的對比。將GeneCopoeia的NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®和KAPA Library Quantification Kits for Illumina platforms的標準品用BlazeTaq NGS qMix在ABI ViiA 7進行擴增。 兩套標準品擬合出的標準曲線基本重合，對應濃度的標準品的△Ct＜0.3。

 

       4：文庫擴增效率: 對不同類型的10種illumina文庫使用NGSquant™ Library qPCR Kit for Illumina®分別檢測，每個文庫樣本進行6個梯度的10倍稀釋，計算出的擴增效率如上圖顯示，10個文庫的擴增效率均在90%-110%的范圍內，與擴增DNA標準品的效率相近。

 

產品名稱	描述	貨號	規格
NGSquant™ Library qPCR kit for Illumina®	用于Illumina 二代測序平臺的文庫定量試劑盒	QP100	500 rxns
NGSquant™ DNA Standard for Illumina®	文庫DNA定量標準品(濃度：20 – 0.0002 pM）	QP101	80 μL/管

 

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