在全國疫情逐步清零時，北京的疫情卻出現了“反彈”，牽動著全國人民的心。截止6月18日24時，北京8天內已出現新增確診病例183例，還有一些主動篩查中發現的無癥狀攜帶病例。這無疑在告訴我們每一個人：疫情尚未結束，仍需加強防疫！

對于中國乃至整個世界來說，由新冠病毒（SARS-CoV-2) 引起的全球新冠肺炎（COVID-19）大流行疫情，都是一個巨大的挑戰。深入研究嚴重急性呼吸綜合癥（SARS）與宿主分子相互作用機制，探討病毒致病過程，建立SARS病毒感染疾病模型，對于指導臨床治療、疫苗和藥物研發，都具有非常重要的意義。不論是疫苗研發還是新藥研發，以及基因治療，均需要精準的動物模型來驗證疾病的發病和免疫機制。

一、應用小鼠模型研究SARS的意義與優勢？

在研究人病毒感染性疾病中，小鼠模型優勢是非常明顯的，比如，成本較低、容易繁殖飼養、繁殖較快和產仔數較多。更重要的是，近交系小鼠的遺傳背景具有一致性，在此基礎上，可對小鼠基因進行相應的編輯改造建立需要的模型，這都無疑有助于研究宿主特定基因在病毒致病過程中的影響作用，也有利于深入了解病毒或疫苗引起的宿主免疫系統反應及其免疫保護作用。

當然，小鼠模型也存在局限性。由于病毒感染人體或小鼠細胞，常常是通過與宿主體內特殊的細胞表面受體結合，與宿主的先天免疫反應等因素有關，而且，小鼠與人之間的存在一定的物種差異性，導致一些人病毒無法直接感染小鼠，或人病毒雖能在小鼠體內復制，但卻難以引起感染疾病明顯的癥狀表現。所以，將小鼠模型研究結果轉化為人體時，需要謹慎小心。但是，利用各種類型的基因編輯小鼠、人源化小鼠、或者遺傳多樣性的小鼠品系等，從某種程度上可以克服野生型小鼠的短處，使小鼠模型成為研究宿主與病毒致病相互作用，評價疫苗與藥物安全性及有效性的非常有用的研究工具。

二、應用小鼠模型研究SARS-CoV有哪些策略與方法？ 

根據小鼠構建策略與方法不同，目前SARS-CoV感染小鼠模型分為三種：

1.應用人SARS-CoV病毒直接感染近交系小鼠；

2.應用基因編輯小鼠技術，敲除小鼠相關基因，或將人宿主細胞SARS病毒結合受體（比如ACE2）轉入小鼠體內；

3.將野生型SARS-CoV病毒在小鼠體內進行反復適應進化過程，獲得致病性更強的小鼠適應病毒，從而建立能引起明顯臨床表型的病毒感染小鼠模型。

關于SARS-CoV感染小鼠模型，主要的研究進展集中于以下幾個方面： 

（1）直接應用近交系小鼠模型研究SARS病毒致病性

由于SARS-CoV感染人群造成病死率的增加，與年紀較大的患者（大于60歲）發生嚴重急性呼吸道困難綜合癥（ARDS）的增加有關，為了探討能模擬老年人感染SARS-CoV更適合的小鼠模型，有研究分別應用12-14月大的BALB/c、C57BL/6和129S6近交系野生小鼠進行實驗，結果發現，此三種老年小鼠經SARS-CoV感染后，都有短暫（平均約7天左右）的臨床癥狀表型，比如體重減少、亂的毛發、弓背和脫水等，更為重要的是，在組織病理學方面，表現有血管周圍和細支氣管周圍炎性細胞滲入，細支氣管細胞壞死，以及間質性肺炎發生等現象。而且，BALB/c小鼠的廣泛肺泡破壞可持續到第9天，非常接近人SARS-CoV感染的臨床病理癥狀。該研究也是第一次闡明了不同宿主遺傳及年齡特征，可以顯著影響SARS-CoV感染致病性強弱，同時也再次表明，病毒感染性疾病的發生，不僅與病毒本身特性有關，宿主自身相關因素也發揮極為重要的作用。

（2） 應用基因編輯技術建立SARS病毒感染小鼠模型 

關于hACE2遺傳修飾人源化小鼠模型的構建策略，目前通常應用不同的組織特異性或廣泛表達啟動子與hACE2基因構建的表達載體，通過原核注射的方法，獲得隨機插入的轉基因小鼠模型，比如，細胞角蛋白（上皮細胞特異性表達-K18）啟動子；CAG啟動子（廣泛表達）或小鼠ACE2基因啟動子。應用這些ACE2人源化小鼠模型的研究結果表明，hACE2的表達水平高低與其疾病的嚴重程度直接相關。雖然，這些小鼠模型都表現有呼吸道上皮細胞感染，但同時在小鼠腦部也可見高表達的hACE2基因，并在SARS-CoV感染模型中發現，病毒量在小鼠腦部的增加與廣泛擴散，最終導致小鼠發生腦炎而死亡。

（3）應用適應實驗進化方式獲得SARS-CoV變異強毒株 

通過將病毒種植在小鼠特異性組織中，進行適應進化，迫使病毒適應其特定生存環境，并在特定的選擇壓力下發生突變，以達到更有利于其有效復制的目的。為了讓SARS-CoV適應在野生小鼠肺部復制，并引起嚴重急性呼吸道疾病表型，研究者通過對BALB/c小鼠（6周齡）鼻腔反復接種SARS-CoV臨床株15次,直到野生小鼠出現明顯的人感染SARS-CoV的臨床癥狀（比如體重下降等）。通過比較不同傳代獲得的適應致死病毒株，有助于分析病毒引起嚴重呼吸道致病毒力的變化與其蛋白特定突變間的相互關系，為進一步研究特異性SARS-CoV蛋白適應性突變在病毒宿主間作用聯系提供了方便。

（4）應用協同交配（Collaboratory Cross-CC）技術建立遺傳背景多樣性小鼠品系

應用CC小鼠品系建立SARS-CoV感染模型，有助于尋找在病毒致病過程中，是哪些遺傳相關影響因素，決定了宿主對病毒感染性疾病的不同反應。通過用SARS-CoV感染CC小鼠后，分析比較不同表型的CC品系小鼠，比如體重減少的高與低，或病毒滴度的高與低等，達到快速確定與表型相關基因的目的。利用CC小鼠技術，有研究者從SARS-CoV感染致病過程中，尋找到對病毒敏感性完全相反的CC小鼠品系（CC003和CC053/Unc)，基因定位分析發現，在Toll樣受體信號通路中的適配體蛋白Ticam2，是決定嚴重呼吸道疾病表型的潛在關鍵因子。基于這類研究的結果表明，CC小鼠可作為更加客觀模擬人病毒感染疾病臨床表型的一種新型小鼠模型。

三、小鼠模型在新冠病毒（SARS-CoV-2）研究中的應用進展

無論是核酸還是氨基酸序列比較分析都證實，SARS-CoV-2與SARS-CoV的相似性非常高 （分別約為80%和76%），而且SARS-CoV-2也是通過細胞表面的ACE2受體與宿主發生相互作用，引起與SARS-CoV感染相似（雖然不是完全相同）的嚴重急性呼吸道困難綜合癥等臨床表現。因此，上面介紹的針對SARS-CoV感染的相關小鼠模型構建策略與方法，也適合于SARS-CoV-2感染小鼠模型的建立。 目前小鼠模型在新冠病毒感染研究中的最新應用研究都是由中國科學家們完成。

1. 轉基因人源化ACE2小鼠模型

中國醫學科學院醫學實驗動物研究所秦川主導的研究團隊全球首先報道建立新冠病毒感染hACE2小鼠模型，該轉基因hACE2小鼠模型是應用小鼠mAce2啟動子和hACE2基因構建的表達載體，通過原核注射方法獲得動轉基因hACE2小鼠模型。hACE2轉基因小鼠受到SARS-CoV-2病毒感染后，小鼠會出現了體重下降，小鼠肺部可檢測到高水平的病毒載量，且病毒感染小鼠出現中度間質性肺炎，肺泡間質中大量淋巴細胞和單核細胞浸潤，肺泡腔內巨噬細胞聚集等病理學特征。

另外，研究者們還首次應用該hACE2轉基因小鼠對新冠病毒滅活疫的安全性與有效性進行了評價。實驗結果表明，不同劑量和不同時間的滅活疫苗免疫hACE2小鼠，未觀察到小鼠出現炎癥和不良反應。檢測分析滅活疫苗的免疫原性顯示，小鼠體內可被誘導產生針對SARS-CoV-2的S蛋白和RBD特異性的IgG，且針對RBD特異性的IgG占S蛋白抗體反應高達50%，提示RBD是新冠病毒滅活疫苗的主要免疫原。

2. 定點插入人源化hACE2小鼠模型

中檢院實驗動物資源研究所主導的研究團隊首次報道成功構建定點插入hACE2-KI/NIFDC小鼠模型。該人源化小鼠構建策略是將hACE2基因定點插入小鼠mAce2基因啟動子之下，并將tdTomato基因插入到hACE2基因的下游，使該人源化小鼠在內源性mAce2基因的調控下，共表達hACE2和tdTomato基因。SARS-CoV-2病毒經鼻感染青年和老年hACE2小鼠感染后，小鼠的肺、氣管和腦中均出現較高的病毒載量，而在小鼠脾、腎、肝、腸和血清中沒有發現病毒RNA。青年和老年hACE2小鼠均發生了間質性肺炎，表現為炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚和明顯的血管系統損傷。但未見感染小鼠死亡。分析SARS-CoV-2感染小鼠的主要靶細胞表明，Clara細胞分泌蛋白（CC10）陽性Clara細胞是SARS-CoV-2在氣道中的主要靶細胞。

研究還證實，胃內接種SARS-CoV-2也可引起hACE2小鼠感染，并導致hACE2小鼠發生肺部病理變化。

3. 腺病毒載體制備的小鼠模型

廣州呼吸疾病國家重點實驗室趙金存教授團隊利用腺病毒載體（Ad5) ， 在小鼠肺臟轉導表達hACE2，成功建立全球首個非轉基因新冠肺炎小鼠模型。

通過構建CMV啟動子表達hACE2基因的腺病毒（Ad5） 載體(Ad5-CMV-hACE2), 分別經鼻內轉導的方式，在野生小鼠和相關基因敲除小鼠（I型干擾素受體缺陷小鼠或干擾素通路關鍵基因STAT1敲除小鼠）基礎上，建立小鼠肺部表達hACE2基因的小鼠模型。

該種非轉基因人源化hACE2小鼠經SARS-CoV-2感染后，小鼠肺部可檢測到高滴度病毒，并出現體重下降和類似新冠肺炎病人的臨床病理表現。同時，該小鼠模型實驗也證明，I型干擾素和STAT1基因具有潛在抗SARS-CoV-2感染的保護作用。

賽業生物作為模式動物領域發展的領先者，在新冠肺炎疫情爆發初期，便組織研發團隊全力開發新冠小鼠模型。我們利用自主研發的TurboKnockout技術和經過優化的CRISPR-Pro技術同步開展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三種背景品系的人源化hACE2小鼠制備，并綜合考慮不同基因編輯方式的優缺點，設計了多種基因打靶方案與構建策略，以滿足不同研究目的和不同應用方向的需求。

新冠肺炎疫情發生到現在已經有半年時間，而疫苗和抗病毒藥物的研發逐漸明朗，雖然不能馬上用于感染者進行預防和治療，但抗疫取得了階段性的勝利是有目共睹的。在這個過程中，小鼠成了人類抗病毒感染之路上的偉大助手，實現了它對人類的最大價值。人類共同命運，生物和諧生存，愿我們擁有一個更美好的地球家園。

作者

俞曉峰 博士，高級科學家

俞曉峰博士現任賽業模式生物副總裁、高級科學家，負責基因修飾模式動物的研發與技術服務等工作。俞博士在遺傳基因模式動物領域有超過20年研發與管理等方面的豐富經驗，在干細胞相關領域及哺乳動物細胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發表在Nature Immunology，Hum Mol Genet，Mol Cell Biol 等高水平雜志上。加入賽業生物前，俞博士2010-2013年任職于美國應用干細胞（ASC）公司，擔任研發總監，負責基因修飾模式動物的研發與定制服務，并在中國子公司斯坦福生物科技擔任副總裁一職。2009-2010任紐約大學醫學院研究員。2003-2009期間任職于美國基因打靶公司（iTL），作為資深科學家和項目經理負責參與了基因修飾小鼠模型研發方案與策略設計、項目管理、技術人員指導與培訓、以及客戶服務和技術咨詢等方面工作，2007年起負責開發了p53基因不同點突變的人源化腫瘤小鼠模型庫項目。2000年任美國耶魯大學醫學院研究員。1995年獲得軍事醫學科學院博士學位。