童話里的故事都是騙人的，但每個人心中的童話是美好的，充滿著希望和期待。面對新冠病毒疫情時，正是這樣的希望支撐著大家不斷地堅持和奮斗。7月份以來，科學家們通過自主研發、團體合作，中和抗體藥物的開發以及疫苗II期臨床實驗獲得進一步成功，讓人們更加期待在后續實驗中人類與病毒的抗爭有個好的結果。

 

在此，我們將對中和抗體和疫苗設計的相關問題進行討論：中和抗體研究的意義？新冠疫苗目前的成果？我們如何通過模式動物來驗證疫苗的安全及有效性？

 

中和抗體研究

當病毒侵入機體時，機體會產生相應的抗體對病毒進行中和，減少病毒對機體的侵害，阻止病原微生物通過黏附靶細胞受體來入侵細胞。

 

一般來說，對于像新冠肺炎等甲類傳染病的研究，需要在3級以上生物安全實驗室中進行。但在病毒學研究的進程中，研究者們發現，假病毒的應用在探究病毒中和性抗體藥物以及疫苗的研究中大有用途，由于假病毒大多用于病毒展示沒有傳播能力等特質，使得對相應病毒研究的實驗環境并不需要格外嚴格，只要在生物安全2級以上就可以操作。

 

對于冠狀病毒假病毒中和抗體的研究，我們還得從SARS說起，早在2005年，SARS病毒突然爆發，搞得人們措手不及。雖然說SARS病毒來去匆匆，使得很多相關研究被擱淺，但仍然有很多項目被執行了下來，對我們應對今天的SARS-CoV-2不無借鑒意義。首先，我們來看一下，2005年英國倫敦大學Robin A. Weiss教授團隊在Emerging infectious Disease上發表的文獻：Longitudinally Profiling Neutralizing Antibody Response to SARS Coronavirus with Pseudotypes。文中指出，SARS-CoV棘突蛋白S是中和抗體的主要靶標，通過構建逆轉錄病毒S相關假病毒，成功制備SARS-CoV的中和抗體，并發現該抗體對患者SARS-S蛋白具有中和反應。這項研究對于自然感染過程中的中和抗體效價及疫苗臨床前評估具有重要的意義。同時，研究者在小鼠和倉鼠中進行的臨床前研究發現中和抗體可明顯抵御活病毒的攻擊，這些研究結果說明，中和抗體藥物的研究在一定程度上可以抵抗病毒的侵襲。

 

我們再把時間拉回到2020年3月，中國醫科院病原微生物研究所在Nature Communication上發表研究論文，利用假病毒系統證明了SARS-CoV-2-S 蛋白在病毒入侵細胞時表現出哪些特征，并對其與SARS-CoV產生的免疫交叉反應進行了闡述。該研究使用慢病毒SARS-CoV-2-S假病毒系統，確定了Huh7、Vero81、LLCMK2、Calu3等細胞對于該系統易感，文中還詳細論述了病毒與受體ACE2結合進入細胞的途徑。我們知道，CoV S蛋白是典型的I類病毒融合蛋白，需要蛋白酶切割來激活S蛋白的融合潛能，在病毒S蛋白的S1和S2之間進行切割，根據病毒株和細胞類型，CoV S蛋白可能會被一種或幾種宿主蛋白酶切割，包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS-2）、TMPRSS-4或人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶（HAT）。這些蛋白酶在靶細胞上的存在很大程度上決定了冠狀病毒是通過質膜還是通過胞吞作用進入細胞。

 

圖1. SARS-CoV-2-S假病毒侵入細胞

(Xiuyuan Ou et al. 2020)

 

研究進一步使用可溶性hACE2的流式細胞術和競爭抑制實驗分析驗證了SARS-CoV-2和SARS-CoV兩種病毒的S蛋白都以hACE2作為病毒結合的受體。

 

冠狀病毒S蛋白是病毒毒力的關鍵因子，是決定病毒毒力、組織嗜性和宿主范圍的關鍵部分，也是中和抗體和疫苗設計的主要靶標。那么對于SARS-CoV-2-S與SARS-CoV-S產生的免疫交叉反應是如何體現的呢？

 

圖2. SARS和COVID-19患者血清的有限交叉中和反應

(Xiuyuan Ou et al. 2020)

 

研究發現康復的SARS患者的血清對SARS-CoV S假病毒顆粒的入侵表現出強烈抑制作用，并且對SARS-CoV-2 S假病毒顆粒具有適度的中和活性。

 

隨著時間的推移，7月份中和抗體的研究結果逐漸浮出水面，各種友好的結果讓我們對抗疫的未來充滿了信心。7月9日，北京大學基因組學先進創新中心（ICG）和生物醫學先鋒創新中心（BIOPIC）等單位合作在Cell上發表文獻，通過對新冠肺炎康復患者的B細胞進行高通量單細胞測序，鑒定出了針對SARS-CoV-2的有效中和抗體。

 

圖3. SARS-CoV-2中和抗體的產生

(Yunlong Cao et al. 2020)

 

研究通過高通量scRNA/VDJ-seq測序，鑒定了8,558個IgG1+抗原結合克隆型，從60名康復患者中發現14種有效的SARS-CoV-2中和抗體，還用SARS-CoV-2真病毒和SARS-COV-2 VSV假病毒系統進行驗證，發現其中最有效的中和抗體是BD-368-2，而且BD-368-2對感染SARS-COV-2的hACE2轉基因小鼠表現出較強的治療和預防作用。同時，研究利用了生物信息學的分析方法，對單克隆抗體CDR3H結構進行預測，驗證實驗發現，mAb中與SARS-CoV中和抗體m396高度相似的CDR3H結構對SARS-CoV-2具有非常高的中和效力。

 

圖4. BD-368-2對感染SARS-CoV-2的hACE2轉基因小鼠有較高的治療和預防作用

(Yunlong Cao et al. 2020)

 

7月23日，中科院生物物理所王祥喜研究員與多個團隊合作，通過噬菌體展示技術構建了冠狀病毒抗體庫，經過高通量篩選鑒定出了一株對β冠狀病毒具有廣譜中和能力的抗體H014。

 

圖5. 交叉中和抗體H014的驗證

(Zhe Lv et al. 2020)

 

人源化單克隆抗體H014，通過與S受體結合域（RBD）結合，可有效地中和假病毒SARS-CoV-S PSV以及真病毒SARS-CoV-2。在hACE2小鼠模型中，H014的給藥可降低感染肺部的SARS-CoV-2病毒滴度，減輕肺部病理變化。

 

以上研究為我們提供了中和抗體篩選的方式以及相應的驗證結果，對抗病毒藥物的開發具有重要的指導意義，同時，為疫苗靶點的探索指明了方向。

 

新冠疫苗的研發進展

截止7月21日，世界范圍內已經有25種新冠候選疫苗進入臨床試驗階段，其中至少有4種疫苗進入III期臨床試驗。

 

疫苗是將病原微生物經過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制備的用于預防傳染病的自動免疫制劑。傳統的疫苗分為人工主動免疫和被動免疫疫苗，人工主動免疫疫苗分為三類，一是滅活疫苗，二是減毒活疫苗，三是類毒素疫苗。人工被動免疫的方式有以下四種，一是抗毒，二是人免疫球蛋白制劑，三是細胞因子制劑，四是單克隆抗體制劑。兩種方式的免疫均能使機體增強抗病能力，減少傳染病的發生。科技的進步帶來了疫苗制備方式的創新，根據不同制備方式，目前已有的新型疫苗類型有亞單位疫苗、結合疫苗、合成肽疫苗和基因工程疫苗（重組抗原疫苗/重組載體疫苗/DNA-RNA疫苗/轉基因植物疫苗）。

 

回到新冠疫苗的研究上，2020年7月14日，美國Moderna公司研發的候選疫苗mRNA-1273在100mg免疫劑量下可激發人體較好的中和抗體反應和偏向于Th1 CD4型細胞免疫應答，不良反應相對溫和，后期的臨床試驗正在進行。7月20日，牛津大學和軍事醫學科學院陳薇院士團隊腺病毒載體疫苗 ChAdOx1 nCoV-19（AZD1222）II期臨床結果揭曉，令人興奮的是，該研究評估了腺病毒Ad5載體的候選COVID-19疫苗的免疫原性和安全性，確定候選疫苗的合適劑量用于下一步的有效性研究。同在7月20日，德國 BioNTech 公司聯合美國輝瑞等機構在預印本網站medRxiv發布了RNA疫苗的1/2期臨床試驗結果。通過脂質納米顆粒處理的RNA疫苗能激發受試者細胞免疫應答和體液免疫應答。研究發現，BNT162b1編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的受體結合域（RBD），BNT162b1表達的RBD抗原與T4纖維蛋白衍生的“foldon”三聚結構域融合，通過多價重組增加其免疫原性。

 

這些成果的展示，體現了科技的發展與人類的進步，但是在疫苗安全效用評估的過程中，我們不得不充分考慮到ADE（antibody-dependent enhancement）效應的出現。

 

那么什么是ADE呢？早在1964年，Hawkes等在蟲媒病毒的研究中提到了“抗體依賴性感染增強”的假說，ADE主要表現為病毒在低濃度免疫血清中的復制被促進而不是被抑制，這也是當初登革熱出血癥和登革熱休克綜合癥產生的主要原因。而對于新冠病毒，是否也會出現這樣一種令人擔憂的現象呢？

 

圖6. 冠狀病毒抗體反應的潛在結果

a. 在抗體介導的病毒中和過程中，與病毒刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）以及其他結構域結合的中和抗體可防止病毒黏附于受體ACE2上。

b. 在感染的抗體依賴性增強過程中，低質量、少量和非中和性抗體會通過Fab結構域與病毒顆粒結合。單核細胞或巨噬細胞上表達的Fc受體（FcR）與抗體Fc結構域結合并促進病毒的進入和感染。

c. 在抗體介導的免疫增強過程中，低質量、少量和非中和性抗體與病毒顆粒結合。Fc結構域與受體結合后，FcR啟動信號，促炎性細胞因子上調同時抗炎性細胞因子下調。免疫復合物和病毒RNA通過Toll樣受體3（TLR3）、TLR7或TLR8發出信號以激活宿主細胞，從而導致免疫病理學現象的發生。

 

研究表示，在SARS-CoV感染中，ADE是由于病毒與在不同免疫細胞（包括單核細胞、巨噬細胞和B細胞）上表達的Fc受體（FcR）結合而發生的。預先存在的SARS-CoV特異性抗體可能會促進病毒進入表達FcR的細胞。實際上，通過ADE感染巨噬細胞不會導致有效的病毒復制和脫落。相反，病毒抗體免疫復合物的內化可通過FcRs5激活髓樣細胞來促進炎癥和組織損傷。通過此途徑進入的病毒可能會與模式識別受體TLR3、TLR7和TLR8結合。巨噬細胞通過ADE吸附SARS-CoV病毒導致TNF和IL-6的產生升高。因此，在對疫苗進行研發的過程中，我們不得不考慮可能出現的ADE效應。那么，如何能夠最大限度地避免該現象在人體中發生，那就是疫苗應用前的模式動物安全性驗證。

 

模式動物應用于疫苗安全性驗證

6月份，趙金存教授團隊研發制備腺病毒載體新冠小鼠模型，通過實驗驗證，發現該方法所制備的小鼠模型能夠產生有效的中和抗體，對疫苗和藥物評價具有非常重要的意義。同時，華盛頓大學醫學部也利用AdV-hACE2模型制備了高效中和抗體，到7月份，疫苗的研究進展相繼被報道，美國Moderna公司開發的mRNA-1273和德國BioNTech等機構研發的納米顆粒mRNA疫苗取得了有效進展，激發了受試者產生免疫應答并產生中和抗體。我國陳薇院士團隊聯合牛津大學制備的腺病毒載體疫苗ChAdOx1 nCoV-19同樣產生了令人期待的好結果。

 

這些研究，無一不讓我們更加期待模式動物的廣泛應用。疫情給我們最深的體會大概就是，有史以來全民對病毒的了解恐怕沒有比新冠病毒更深入的了。隨著科技的進步，全球醫療健康水平會進入到一個新的階段，人們對生命本質的了解會更加透徹。

 

童話很美好，我們的未來也可期。

 

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