瓊脂糖珠


長久以來，多孔的瓊脂糖珠 (也稱瓊脂糖樹脂) 作為免疫沉淀實驗中的固相支持物常用的材料。

瓊脂糖珠海綿狀的結構  (直徑 50-150 μm)  可以結合抗體  (繼而結合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結合抗體，而不需借助特殊的專業設備。

圖 1. 瓊脂糖珠

 

在無需抗體飽和的情況下，瓊脂糖珠能很好的結合極大量目的蛋白。但值得注意的是，在免疫沉淀實驗中，抗體的量常常不足以滿足瓊脂糖珠的飽和荷載量，沒有被抗體覆蓋的瓊脂糖珠的部分則可以自由地結合任何可粘附的物質，這種非特異性結合升高引起背景信號升高，這時，“高荷載量優勢”會變成“高荷載量劣勢”。對裂解樣本進行預處理操作，是去除非特異性結合物最為簡單有效的方法。

 

■ 預處理

 

裂解樣本是蛋白質、脂質、碳水化合物和核酸的混合物，與抗體、蛋白 A/G、微珠材料會發生非特異性結合，從而對免疫沉淀結果造成影響。主要方法有兩種：

 

a. 排除由于微珠本身材質引起的非特異性結合：將裂解樣本與微珠單獨混合孵育，隨后去除微珠并收集上清液，再進行免疫沉淀實驗。

 

b. 排除由細胞成分引起的非特異性結合：使用相同抗體亞型類別但不靶向目的蛋白的抗體，在相同的組分條件中與裂解樣本混合孵育，再進行免疫沉淀實驗。

磁珠


目前，超順磁性微珠已經大幅取代瓊脂糖珠，成為免疫沉淀和其他微量親和純化方法的首先選擇。

 

與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結合僅限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結合能力，但每體積的磁珠數量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結合表面積滿足高容量的抗體結合。

 

圖 2.  磁珠

 

磁珠 VS 瓊脂糖珠

	Magnetic Beads	Agarose Beads
Capacity	++	+++
Yield	+++	++
Reproducibility	+++	++
Purity-Specificity	+++	+
Easy of Use	++++	+
Speed	++++	+
Multiple Samples	+++	+
Automation	+++	-

 

■ 結合能力

由于瓊脂糖珠直徑較大且具有海綿狀結構，因而比磁珠有更大的表面積和更大的結合能力。但是瓊脂糖珠的可變多孔徑會使抗體會落入孔內，導致結合受限，尤其是超大蛋白 (一般是蛋白復合物) 的結合，并且抗體可能會在洗滌步驟 (離心) 中流失。 相反，綁定在磁珠表面的抗體均能與目的蛋白結合，并且抗體很少會在溫和的洗滌步驟 (磁性分離) 中流失。

 

另外，瓊脂糖珠的非特異性結合能力大于磁珠。 瓊脂糖珠的非特異性結合不限于其表面抗體結合位點，抗體的任何表面或參加免疫沉淀反應的成分均可與樣品中非目的蛋白成分結合，即使使用完全飽和的珠子，仍會發生非特異性結合。因此，進行免疫沉淀之前預處理樣品極為重要。

■ 成本

免疫沉淀中設計微珠的成本主要取決于免疫沉淀方法和每個免疫沉淀反應所需要的微珠量。

瓊脂糖珠：瓊脂糖珠必須通過離心濃縮在管底部，并在每次孵育和洗滌除去上清液，通常需要肉眼識別管底部的瓊脂糖珠，因此，每個免疫沉淀實驗至少需要使用 25-50 μL 的瓊脂糖珠。

 

磁珠：采用磁性分離，無需設定最小體積的的磁珠使用量，用量僅取決于目的蛋白和免疫沉淀抗體。

 

當然，在使用瓊脂糖珠的過程中，可以使用過濾離心柱代替普通的微量離心管，該離心柱包含一個過濾器，允許通過短暫的離心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流過，因此可以顯著減少每個反應所需的瓊脂糖珠使用量。

 

■ 簡單快速

由于瓊脂糖珠免疫沉淀需要較長的孵育時間，預處理步驟和多次離心，所以其需要大量的手動操作，總時間為 1-1.5 小時。相反，磁珠免疫沉淀反應不需要離心，配合使用磁性分離架磁性分離，在 30 分鐘內即可完成實驗，因此可以在較短時間內輕松處理并獲得較多樣本的分析數據。

■ 自動化

磁珠操作簡便，因此可以使用自動化免疫沉淀設備，不僅節省了工作量和時間，還可以應用于高通量。

總結

當樣品體積< 2 mL，建議使用磁珠 。在日常小型分離特定蛋白質和蛋白復合物時，以及進行手動和自動化標準 IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 Pull-down 反應并立即用于后續檢測分析時，磁珠是最佳選擇。

 

當樣品體積> 2 mL，建議使用瓊脂糖珠 。 當抗體成本較低并且想要純化大量目的蛋白用于多種下游分析時，瓊脂糖珠是最佳選擇。