在多色流式中常常會使用到偶聯染料。然而由于偶聯染料的特殊性，在使用上也有特殊要求，今天我們就來聊聊怎么用好偶聯染料。

 

什么是偶聯染料？

 

偶聯染料由兩個共價連接的熒光分子組成。這些分子之一是蛋白質（即PE，APC）或合成染料（即BV421™），其特征在于消光系數（吸收能量的能力）大的一方可作為供體，而第二個分子是作為受體的小型合成染料（即Cyanine5，Cyanine7）。

 

圖1 常見的偶聯染料分類和特性

 

我們為什么要使用偶聯染料？

 

眾所周知，一個樣本可以同時使用的熒光素的數量受到流式細胞儀上激光器和檢測器數量的限制（表1）。當前市場上最先進的細胞儀儀器有5種激光器，包括紫外線（355 nm），紫色（405 nm），藍色（488 nm），綠色（532 nm）或黃綠色（561 nm）和紅色（633 nm） ，并有可能在每個激光器上集成8個甚至更多參數。但是，目前還沒有足夠的光譜不同的熒光素來填充此配置。如果沒有偶聯熒光素，則每個激光器僅適合分開激發少量熒光素，從而嚴重限制了可檢測參數的總額。

 

表1. 不同激光器、檢測器和儀器下可用的多色流式panel示例（非最新配置信息）。

 

進一步擴大每個激光探測器的數量，使得多色流式panel可以增加到21種顏色/ 23個參數（表1）。也正是因為偶聯染料具有激發供體受體發射的這種特性，才使得擴大多色流式panel可以實現。因此，盡管供體染料和其tandem被相同的激光激發，但是通過使用不同的檢測器讀出它們的發射光，它們可以在同一panel中使用。舉例來說，圖1展示了BV421™及其偶聯熒光素的激發和發射光譜。

 

假使想更進一步擴展多色流式panel，可以使用光譜細胞儀來實現。該儀器目前最新的參數是可配置五個激光器，64個熒光檢測通道。以Cytek^® Aurora為例，Cytek成功開發了一個40色的免疫分型方案，僅從一根試管中進行細胞獲取，便可獲得具有出色分辨率的實驗結果。光譜檢測系統沒有利用傳統的補償計算方法，而是允許同時使用具有顯著重疊發射光譜的熒光團（即BV750™和BV785™），無需擔心補償問題。

 

圖2. BV421™及其偶聯熒光素BV570™，BV605™，BV650™，BV711™，BV750™，BV785™的激發和發射光譜。

 

偶聯染料如何工作？

 

供體熒光團吸收特定波長的光能，激發后，能量通過稱為Förster共振能量轉移（FRET）的現象（也稱為熒光共振能量轉移）從供體轉移到受體。受體以熒光的形式發射轉移能量。當FRET效率很高時，將在受體通道中觀察到強信號，而在供體通道中觀察到弱信號。請注意，FRET效率永遠不會達到100％，這意味著在供體通道中會有一些溢出或滲漏。當然這取決于偶聯染料的質量。為正確分析，建議使用同型對照作為背景，單染對照來適當地調整補償，FMO（(Fluorescence-minus-one）對照來畫門。

 

我在供體通道中看到了熒光信號。我的偶聯染料是否降解了？

 

沒有。這是一個常見的誤解。供體和受體染料共價結合，通常供體和受體不會在溶液中分開，不會降解。如前所述，由于FRET效率不是100％，因此在預期中便有熒光溢出或滲入供體通道。為了準確地補償溢出，重要的是使用與多色樣品相同的抗體作為單色補償對照，并與多色樣品一樣去處理它們，尤其是在一樣的光照和固定條件下。但是，如果在供體通道中觀察到強信號，在受體通道中觀察到弱信號，則表明FRET效率低，可能是由以下因素引起的：

• 光漂白。所以需要始終保護偶聯染料免受光或其他氧化應激源的影響，因為它們極易受到氧化引起的光漂白。這種情況下會導致偶聯功能喪失，并且不可逆。

• 暴露在冷凍溫度下。不要冷凍偶聯熒光抗體，它可能導致基于蛋白質的供體熒光團變性。

• 固定和通透性。不要長時間將細胞置于固定液中，因為這會導致自發熒光增加，并對偶聯造成成更大的傷害。強烈建議固定后清洗細胞，并用FluoroFix™緩沖液（Cat#422101）替換普通緩沖液。雖然固定后也可以進行表面染色，但是，請務必查看我們的“fixation”頁面（https://biolegend.com/fixation）以了解我們的抗體克隆與固定液的兼容。

 

不同固定劑會如何影響偶聯染料熒光信號？這里有個例子，圖2展示了用PerCP/Cyanine5.5-偶聯抗體染色細胞并暴露于1％PFA或True-Phos™ Perm緩沖液（Cat#425401）中，再來看細胞的熒光信號。由于PerCP偶聯熒光是一種基于蛋白質的染料，所以當它暴露于基于甲醇的True-Phos™ Perm緩沖液中會導致PerCP變性，以致PerCP信號丟失，但不會導致其受體Cyanine5.5失去信號，該受體的熒光可以在AlexaFluor^® 700通道中檢測到。

 

圖3. A 暴露于1％PFA或True-Phos™ Perm緩沖溶液中時，PerCP/Cyanine5.5抗CD14抗體染色的熒光強度。B點圖，表明將PerCP/Cyanine5.5暴露于True-Phos™ Perm緩沖液后，AlexaFluor^®700通道中出現的信號。

 

成功使用偶聯熒光抗體的小秘訣

 

• 避免長時間暴露在強光線下，以及減少溫度劇烈變化。光線會使偶聯熒光光漂白，始終保護樣品和抗體免受光照。不要冷凍偶聯熒光抗體，因為這可能導致供體蛋白變性。

• 避免“過分固定”。我們建議在短時間內（不到30分鐘）固定偶聯熒光，然后將其清洗并重懸在Cell Staining緩沖液中進行保存。為此，我們提供了專門配制的FluoroFix™緩沖液（Cat#422101），用于固定偶聯染料。

• 對帶有偶聯熒光的多色流式實驗進行檢測時，請注意受體分子的跨激發光激發。在大多數情況下，可以通過補償來分析。例如，已知PE/Cyanine5中的Cyanine5受體可被紅色激光激發，因此與APC結合使用時要格外小心。

• 在4°C或冰上標記細胞。APC偶聯熒光可能容易受細胞介導的去偶聯作用，因此在低溫下減慢細胞新陳代謝可以幫助保持偶聯的穩定性。

• 為避免基于Cynanine的染料（即PE/Cyanine7，APC/Cyanine7）與單核細胞和巨噬細胞非特異性結合，我們建議使用True-Stain Monocyte Blocker™（Cat# 426103）。