這段時間普通民眾都是談新冠病毒色變，無非印證了一句話「人們對不了解的事物才會感到恐懼」。為了減少我們的恐懼感，讓我們來深入了解新聞發布會上不斷提及的「新冠病毒核酸檢測」吧。

首先分享中國疾控中心發布的檢測新冠病毒的引物、探針序列：

推薦選用針對新型冠狀病毒的開放讀碼框 1ab（open reading frame,ORF1ab）、核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因區域的引物和探針。

Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）：
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

這是個好消息，比較專業的同學一看就明白，根據上述疾控中心提供的資料合成引物探針后，再買個類似 Simgen 的 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Cat. No. 406100）預混 RT-PCR 試劑，就可以自制新冠病毒核酸檢測試劑盒了。不過問題來了，核酸檢測由兩塊內容組成：核酸提取+PCR 檢測，僅有 RT-PCR 試劑是不夠的，對于病毒 RNA 檢測來說，病毒 RNA 提取反而是核酸檢測的重頭戲：因為樣本中病毒 RNA 的數量通常很低（pg 級別）且容易降解，提取過程費時費力，以至于病毒 RNA 的回收效率直接就決定了檢測的靈敏度，所以才會有一些不負責任的核酸診斷試劑廠家采用了逃避手法：只提供熒光 PCR 檢測試劑，讓用戶自己去找核酸提取方法……好吧，假如你運氣不好，需要自己選擇病毒核酸提取方法，此文章應該挺有價值，我們以實驗室最常見的 Trizol 試劑來進行病毒 RNA 的提取。

需要說明的一點是：我們實驗室不是 P3 實驗室，不敢玩非冠病毒，我們還是以同樣是 RNA 病毒的丙肝病毒血清樣本進行測試的，請大家諒解。

一、樣本、試劑與儀器

丙肝病毒陽性血清，**** 醫院檢驗科提供，經達安基因公司丙型肝炎病毒 (HCV) 核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）  產品檢測病毒濃度為 10⁵ copies/ml。

用混合的人陰性血清將 10⁵ copies/ml 丙肝病毒陽性血清病毒稀釋 10 倍獲得 10⁴ copies/ml 血清；再用混合的人陰性血清將 10⁴ copies/ml 丙肝病毒陽性血清病毒稀釋 10 倍獲得 10³ copies/ml 血清。

Simgen 病毒核酸純化試劑盒（Cat. No. 4002050），Simgen Trizol 試劑（Cat. No. 5301100），Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）
HCV 檢測試劑盒：Acon 丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒 (PCR-熒光法)
PCR 儀：ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System
離心機：Thermo Biofuge pico

二、測試方法 

1、用 Simgen 病毒核酸純化試劑盒、Trizol 加 Carrier RNA、Trizol 試劑分離純化同一管 10³ copies/ml 血清樣本中的病毒 RNA。（Trizol 提取方法：1 ml Trizol 試劑/1 ml Trizol 試劑含 3 µl Carrier RNA + 200 µl 血清混勻→+氯亻方混勻→離心取 750 µl 上清+600 µl 異丙醇→離心后用 75% 乙醇洗滌→50 µl RNase-free 水溶解，具體細節請自行腦補）

2、三種方法每次均從 200 µl 血清中分離純化病毒 RNA，各做兩管，RNA 最終洗脫/溶解體積為 50 µl。

三種病毒 RNA 提取方法獲得的病毒 RNA 均取 10 µl 作為模板擴增，終反應體積為 40 µl，使用同一批次的 Acon 丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒 (PCR-熒光法) 進行擴增。（注：Acon 丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒 (PCR-熒光法)RT-PCR 實際循環數為 45 個循環，反應條件如下：42℃ 30 min,  95℃ 3 min,  [95℃ 10sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1 min(5 次循環)]，[95℃ 5sec, 60℃ 32sec (40 次循環)]）

三、實驗結果

反應體系的陰性對照中加 10 µl 水作為模板，檢測結果為陰性。
 

用不同方法提取的 10³ copies/ml 血清樣本，檢測結果如下圖：
 

四、分析與討論 

1. 從檢測結果看，Trizol 試劑終究還是擴增起線了，只是 CT 值很大，趴下去了。Trizol 試劑加了 Carrier RNA 后起線正常。但是比病毒核酸純化試劑盒大了差不多兩個 CT 值。

2. Trizol 試劑在提取 10³ copies/ml 血清樣本的時候，起線艱難，我們很擔心提取 10² copies/ml 血清樣本的時候還能不能起線，所以我建議那些宣傳自己產品檢測靈敏度高達 10² copies/ml 的廠家，是不是要限制一下配套的病毒核酸提取方法，否則有虛假宣傳的嫌疑。現在新聞中也經常在爭論新冠病毒核酸檢測方法為什么有假陰性的問題，個人認為由于病毒 RNA 樣本的特殊性，咽拭子樣本的采樣方式、保存條件，再到核酸提取，每個環節都有可能會影響到后續 PCR 檢測的靈敏度，所以國家藥監局在審批新冠病毒核酸檢測試劑盒的時候應該優先通過包含病毒核酸抽提試劑的產品，這類企業提供的產品測試結果才會有比較高的穩定性。

3. Trizol 試劑加了 Carrier RNA 后，起線簡直有了質的飛越，怎么解釋？其實也簡單：pg 級的病毒 RNA 沉淀效率太低了，但是在純化體系中加了 µg 級的 Carrier RNA 后，沉淀病毒 RNA 效率完全就不是一個級別的了，我們一起看下照片：
 

大家都知道，RNA 比 DNA 要脆弱得多，很容易降解，當然 100℃ 不失活的強悍 RNA 酶是罪魁禍首，當 Carrier RNA 存在時，對于掩護病毒 RNA 不被 RNA 酶攻擊，也是有重大意義的。Trizol 試劑提取的病毒 RNA 擴增曲線趴倒，不排除病毒 RNA 被降解，導致擴增困難的可能性。

4. 雖然 Trizol 試劑加了 Carrier RNA 后起線好了很多，但是和病毒核酸純化試劑盒比較，還是大了兩個 CT 值，也就是說病毒核酸純化試劑盒提取病毒 RNA 的效率是 Trizol 試劑+Carrier RNA 的 4 倍，怎么解釋呢？這要從 Trizol 試劑提取 RNA 的原理說起：Trizol 是硫氰酸胍+笨酚+乙酸的混合物，硫氰酸胍負責變性溶解蛋白（對于病毒顆粒最有價值的是溶解蛋白外殼）；笨酚負責萃取變性的蛋白質；乙酸負責維持低 pH 值，確保 DNA 維持不溶解的狀態。首先在溶解病毒顆粒的環節，以胍鹽溶解蛋白（病毒顆粒）的效率低于蛋白酶 K 消化蛋白（病毒顆粒），使得病毒 RNA 的釋放效率低了一級，其次又在笨酚萃取的環節，由于刻意的調低 pH（目的是去掉 DNA，個人認為調高 pH 有助于病毒 RNA 的回收效率，畢竟宿主的 DNA 并不干擾病毒 RNA 的擴增），導致一部分病毒 RNA 又隨著相間沉淀丟失了。兩個不利因素的累積，是 Trizol 試劑提取病毒 RNA 效率低的主要原因。

其實 Trizol 試劑用作病毒 RNA 的提取，并非是 zui 好的選擇，但優點是幾乎所有的分子生物學實驗室都能拿到。Trizol 試劑用作新冠病毒 RNA 檢測時，靈敏度要達到 10² copies/ml 應該是有困難的，如果用 Trizol 試劑檢測某些樣本的結果和本次實驗相似（趴倒的線），建議在 Trizol 試劑中補加 Carrier RNA，或者購買病毒核酸純化試劑盒重測，以免漏檢或者誤判陽性樣本。