多肽類藥物作為大分子藥物和小分子藥物之間的過渡態(tài)，也一直是制藥領(lǐng)域關(guān)注的熱點。
多肽/蛋白質(zhì)都是由氨基酸這個基礎(chǔ)單元通過肽鍵（酰胺鍵-CO-NH-）及其他鍵鍵合而成的。目前，對于多肽并沒有一個十分嚴(yán)格的劃分規(guī)定，通常認(rèn)為20個以下氨基酸組成的為短肽，也有認(rèn)為5/10個氨基酸以下組成的為短肽；由20~50/60個氨基酸組成的肽為中等肽。而我們一般認(rèn)為的肽類藥物為2~60個氨基酸組成，更大的結(jié)構(gòu)或者是更大的分子量（>5000）則會被歸入大分子/蛋白類藥物中。
氨基酸作為組成多肽/蛋白質(zhì)的初級單元，每個氨基酸均由一個羧基（-COOH），一個氨基（-NH2）和一條側(cè)鏈組成。而不同氨基酸之間的差異在于側(cè)鏈的不同。
天然氨基酸都是α氨基酸，對于氨基酸特有的結(jié)構(gòu)來說，其包含一個酸性基團-COOH，和一個堿性基團-NH2。其pKa如下圖所示： 除去上述氨基酸特有的基團外，對常見的氨基酸根據(jù)側(cè)鏈的不同性質(zhì)進行分類（酸性、堿性、中性；脂肪族、芳香族等），如下圖所示：
1、酸性 對于酸性的氨基酸，上圖中所標(biāo)pKa為紅圈圈出位置，用紅色圈表示酸。
2、堿性 對于堿性的氨基酸，上圖中所標(biāo)pKa為藍圈圈出位置，用藍色圈表示堿。
3、芳香族 對于苯丙氨酸和色氨酸來說，除氨基酸本身代入的α氨基酸結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈可能帶進酸性基團或者堿性基團。如上圖中三個芳香族類的氨基酸中，酪氨酸的側(cè)鏈就帶進一個酚羥基的弱酸。
4、脂肪族 5、亞胺（成環(huán)） 6、脂肪醇類 7、含硫氨基酸 含硫氨基酸具有還原性，其較易氧化。另一個需要關(guān)注的地方是，當(dāng)多肽鏈中因存在半胱氨酸、蛋氨酸而存在二硫鍵二級結(jié)構(gòu)時，需要特別關(guān)注穩(wěn)定性過程中二硫鍵交換的產(chǎn)物。
8、酰胺類 末端的酰胺作為一個非常弱的酸/堿，在一般的分析條件下，可處理為中性，在分析過程中不用過多的考慮。當(dāng)然這里的不用過多考慮僅僅指分析方法design的時候。在多肽藥物的穩(wěn)定性過程當(dāng)中，如果肽鏈中存在此類氨基酸，需要特別關(guān)注水解的雜質(zhì)。
我們了解了形成多肽/蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)單元——氨基酸。多個不同或者相同的氨基酸通過酰胺鍵（肽鍵）結(jié)合，形成氨基酸序列，即一級結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)通常以無規(guī)則卷曲的方式存在，如下圖所示： 在某些氨基酸序列中，某些氨基酸通過分子內(nèi)相互作用，形成α-單螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)，以使得該結(jié)構(gòu)能量最低而使其結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。α-單螺旋是其一級結(jié)構(gòu)中位于四個氨基酸間隙的殘基相互作用形成氫鍵，從而穩(wěn)定整個分子的結(jié)構(gòu)；β-折疊結(jié)構(gòu)是通過一級結(jié)構(gòu)中相鄰的線性段之間形成氫鍵來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。為使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定而形成的分子內(nèi)折疊稱為二級結(jié)構(gòu)，如下圖所示： 在某些氨基酸序列中，某些氨基酸通過分子內(nèi)相互作用，形成α-單螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)，以使得該結(jié)構(gòu)能量最低而使其結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。α-單螺旋是其一級結(jié)構(gòu)中位于四個氨基酸間隙的殘基相互作用形成氫鍵，從而穩(wěn)定整個分子的結(jié)構(gòu)；β-折疊結(jié)構(gòu)是通過一級結(jié)構(gòu)中相鄰的線性段之間形成氫鍵來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。為使結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定而形成的分子內(nèi)折疊稱為二級結(jié)構(gòu)，如下圖所示： 在反相色譜分析過程中，蛋白質(zhì)由于發(fā)生變性而失去二級、三級、四級結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象非常常見；但在離子交換或者體積排阻色譜中，卻很少發(fā)生蛋白質(zhì)變性。
多肽/蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)就簡單介紹到這，了解其結(jié)構(gòu)能幫助我們更好的去進行分離分析。
從上一文中我們知道，作為基礎(chǔ)單元的氨基酸除了具有相同的氨基和羧基結(jié)構(gòu)，還具有不同的性質(zhì)，包括酸性、堿性、芳香環(huán)帶進來的大π鍵，巰基等帶來的還原性。這些氨基酸帶進來的不同性質(zhì)決定了其組成的肽/蛋白質(zhì)的性質(zhì)。由于組成的肽鏈/蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量通常都較多，故一個肽可能同時具有多種不同的性質(zhì)。
相較于小分子，肽類因組成的氨基酸數(shù)量較多，通常具有更大的分子量，更大的分子量帶來更大的空間結(jié)構(gòu)。
我們來看3個不同的肽類的空間結(jié)構(gòu)：
1、依來多辛（Eledosin） 作為11個AA（氨基酸）組成的短肽類，其具有相對于一般小分子稍大的結(jié)構(gòu)，如下圖所示： 注：上圖測試出的分子中最遠距離原子間的距離為36.11Å。
2、鮭降鈣素（Salmon calcitonin） 注：上圖測試出的分子中最遠距離原子間的距離為30~40Å。
3、Tesamorelin（替莫瑞林） 注：上圖測試出的分子中最遠距離原子間的距離為170Å以上。
（上述三個多肽的原子間距均是通過MOE能量最小優(yōu)化后測得的原子間距）
從上述三個多肽可以看出，隨著分子量的增加，其空間結(jié)構(gòu)變得更大。對于僅11個氨基酸組成的依來多辛來說，其僅一個方向上原子間距較大（36Å），而對于鮭降鈣素來說，其多個方向上的原子間距達到30Å以上，對于更大體積的替莫瑞林來說，其最大原子間距已達到了170Å以上。當(dāng)然，上述幾個多肽僅作為例子，便于大家的理解，實際上，在溶液中的分子可能具有更小的能量及更小的空間結(jié)構(gòu)。
分子空間結(jié)構(gòu)的大小決定了分析過程當(dāng)中色譜柱孔徑的篩選。 對于反相色譜來說，通常具有從60~300Å孔徑的填料。我們知道，保留行為的發(fā)生都發(fā)生在多孔填料的表面上，而對于多孔材料來說，絕大多數(shù)（>95%）的表面積都分布在小孔內(nèi)部，也即絕大多數(shù)的保留分離行為都發(fā)生在多孔材料的孔內(nèi)。要形成有效的保留，首要的一點就是待分離組分能順利的進入孔內(nèi)。
然而，待分離分子在孔內(nèi)的摩擦系數(shù)較大，會降低進入孔內(nèi)的樣品分子的擴散，使得柱效降低，所以一般要求孔徑要大于樣品分子直徑的4倍以上，才能保證樣品分子能自由出入孔內(nèi)，而維持正常的譜峰展寬。