Molecular Probes熒光標記試劑在活細胞成像實驗中的應用
活細胞成像是研究動態細胞過程和事件最有力的方法，已廣泛應用于許多不同領域。我們可提供全面的活細胞成像實驗流程完整解決方案，助您輕松又簡單捕獲活細胞的精彩瞬間。
Invitrogen Molecular Probes熒光標記試劑是所有生命科學研究同行已發表文獻中應用最為廣泛、引用率最高的試劑，用我們的專業經驗幫助您快速獲取結果。
- 可以觀察動態細胞過程的發生
- 能使用多色檢測同時對幾個細胞過程和細胞功能進行研究和成像
- 可研究細胞在其原生環境中的結構，從而獲得更接近體內環境的更真實結果
- 實現隨時間追蹤細胞生物分子和結構
- 可觀察細胞之間的相互作用
- 讓細胞酶和其他胞質生物分子保留在細胞中
- 必須有一種特定的方法來以最小的毒性標記您的研究靶標-無論是分子、細胞功能還是細胞狀態
- 活細胞通常對于某些大的檢測分子是不可透過的，例如抗體
- 移動的目標會更難保持聚焦
- 使用的某些技術是否可能對活細胞有害
- 細胞必須保持其自然生理狀態
在各種實驗操作、標記檢測和成像觀察過程中一直保持細胞存活和健康并非易事。對于延時成像和細胞長時間暴露于周圍環境條件下的實驗，培養基的選擇尤為重要。若要獲得可靠的活細胞成像實驗結果，非常重要的一點是：細胞必須健康并保持存在盡可能接近生理溫度、pH、氧氣水平及其他條件的環境中。
第 3 步: 細胞標記
應選用合適的熒光染料（特異性靶向的熒光蛋白或小的膜通透性試劑）來檢測目標細胞的結構或過程。可以使用其他熒光染料一起同時檢測多個細胞結構和過程，但需要使用Fluorescence SpectraViewer（熒光光譜查看器）檢查激發光譜和發射光譜以確保不同熒光染料之間符合最小光譜重疊。切記盡量避免使用過多的熒光標記，因為過多的熒光標記會導致：
- 非特異性染色，背景信號增強
- 出現生理偽影和結構擾動
- 細胞毒性
- 光譜重疊嚴重
- 活細胞結構標記試劑——是為了幫助鑒定細胞成份
- 活細胞功能檢測試劑——是為了幫助識別細胞功能和過程
通過使用減少細胞外熒光并能增加熒光染料光穩定性的試劑，可以最大程度的優化信噪比。能夠維持細胞健康同時減少或消除活細胞成像實驗中背景熒光的培養基對于活細胞成像來說非常重要（見表 1）。加入適用于活細胞的背景抑制劑也有助于減少細胞外背景熒光，并且不需要額外清洗步驟。可以將活細胞抗淬滅試劑用于樣品，以減少熒光染料的光漂白，從而防止多次或長時間曝光導致信號丟失。
第 5 步：成像觀察
為了使光毒性最小，推薦選擇可以最大程度地控制光源的成像系統。嘗試使用盡可能低的光強度、曝光時間、波長范圍和激發能量來照亮激發細胞，同時維持低背景下的良好信號。使用能夠以最低的熒光染料激發水平提供最高信號的光照。在某些情況下（特別是當您希望長時間成像時），建議使用較短的曝光時間或較低的放大倍數，犧牲分辨率來獲得更健康的細胞。
較長時間的活細胞成像可能非常具有挑戰性，因為觀察目標可能會在實驗過程中因移動而失焦。許多顯微鏡具有自動聚焦功能，可以幫助您保持更長的目標聚焦時間并減少焦點漂移。另外，將細胞培養在恒定溫度并保持容器中溶液的體積恒定也有助于解決聚焦漂移問題。
許多細胞比較敏感不能允許偏離它們的最佳溫度、摩爾滲透壓濃度、pH 和濕度。具體要求因您所關注的實驗性問題而有所不同。例如，研究細胞生長和分裂的實驗與涉及受體激活和鈣積累的實驗相比可能有不同的要求。一些強健的永生細胞系可以允許短時期的成像或監測，而無需任何環境控制。相反，對于長期成像和檢測研究，永生細胞和原代細胞的良好結果通常需要嚴格控制環境參數。
在加入了Invitrogen CellTracker Deep Red 染料的 HDFn 細胞培養物中的劃痕實驗。（A）對照明區域進行重復照明 10 小時。該區域中的細胞呈現出光毒性跡象（細胞活力喪失，因細胞無法生長到劃痕處）。（B）對比未照明區域中的細胞發現，有活力的細胞可以生長至劃痕上。
上面的細胞顯示出由于過度曝光條件下導致的細胞膜災難性起泡。起泡是用于描述由毒性引起的膜擾動的術語。相比之下，下面這個細胞相對更健康，并且沒有顯示出異常形態。
