Transcriptome sequencing of two wild barley (Hordeum spontaneum L.) ecotypes differentially adapted to drought stress reveals ecotypespecific transcripts

兩種野生大麥（Hordeum spontaneum L.）生態型對干旱脅迫的差異適應的轉錄組測序揭示了生態型特異性轉錄

背景：野生大麥在其地理分布范圍內適應高度多樣的環境。對來自對比環境的不同適應野生大麥生態型進行轉錄組測序有助于鑒定與非生物脅迫耐受和適應有關的基因和遺傳變異。

結果：在受控條件下，分析了來自沙漠（B1K2）和地中海（B1K30）兩種不同環境野生大麥生態型對干旱脅迫的響應。沙漠生態型在灌溉和干旱條件下損失的水分較多，但相對含水量（RWC）和水分利用效率（WUE）均高于沿海生態型。我們用454平臺對兩種生態型干旱脅迫下的葉片的標準化cDNA文庫進行測序，以鑒定干旱相關轉錄本。講閱讀量超過50萬次的每個生態型從頭組裝成20439個B1K2假定的獨特轉錄本（PUTs），21494個B1K30和28720個聯合組裝。每個生態型超過 50% 的 PUT 不與其他生態型共享。此外，16%（3245）的B1K2和17%（3674）的B1K30轉錄本在其他野生大麥生態型和栽培大麥中未顯示同源序列命中，并且是生態型特異轉錄本的備選。每個生態型的800多個獨特轉錄本與30多個不同的應激相關基因同源。我們提取了1017個高質量的SNPs來區分這兩個生態型。沙漠生態型與栽培大麥之間的遺傳距離比地中海生態型與栽培大麥之間的遺傳距離高1.9倍。此外，沙漠生態型比地中海生態型具有更大比例的非同義SNP，這表明這些生態型具有不同的來源歷史。

結論：結果表明，沙漠和地中海野生大麥生態型之間存在強烈的生理和基因組分化，地中海與栽培大麥的關系更為密切。大量野生大麥特有的新轉錄本被鑒定。沙漠生態型中較高的SNP密度和較大比例的具有功能效應的SNP表明地中海和沙漠野生大麥具有不同的來源歷史和自然選擇效應。這些數據是改進基因組注釋、干旱適應轉錄組研究的寶貴基因組資源，也是未來大麥改良的新遺傳標記來源。

圖1.不同土壤含水量下野生生態型大麥生蒸騰作用、葉片RWC和WUE的變化

Barley1K集合中的B1K2和B1K30種質是根據先前的研究選擇的，因為它們對干旱的生理反應存在差異。生理測量在溫室中進行，植物保持在自然光條件和半控制的溫度和濕度下（圖 1A-D）。測量的性狀包括午間全株蒸騰量 (E)、體重增加，損失，這些都根據植物葉面積、水分利用效率 (WUE) 和葉相對含量 (RWC；參見方法) 進行了標準化。出乎意料的是，在灌溉良好（80% 體積含水量）和干旱條件（30% 體積含水量；圖 1E）下，沙漠生態型比地中海生態型品種損失更多的水分。盡管其蒸騰速率較高，但在干旱條件下，沙漠栽培品種比地中海生態型保持更高的 RWC（圖 1F）。此外，植物的累積增重與累積蒸騰作用之間的比率（圖 1G）表明，沙漠生態型的 WUE 高于地中海生態型，其中 WUE 計算為 RWC 與蒸騰速率 E（單向方差分析，p = 0.02）。為了鑒定反映對干旱脅迫的差異反應的候選基因，在干旱處理的第 5 天對來自每個生態型的兩株植物的葉樣本進行采樣以進行 RNA 提取。

圖2. 組裝轉錄本和生態型間同源性概述

使用BLAST將所有PUT相互比較，以確定兩個不同的野生大麥生態型之間共享的同源PUT的比例。兩種不同的生態型共享來自兩種生態型的約 9,546 (29%) 個PUT或46%的B1K2 PUT（圖 2C）。 因此，大多數轉錄本僅限于兩種生態型之一。 生態型之間共享轉錄本的平均長度（B1K2 = 800 bp和B1K30=741 bp）顯著大于（p <0.001）生態型特異性轉錄本（B1K2 = 461 bp 和 B1K30 = 420 bp）。分享比例對于長度超過500和1,000 bp的轉錄本，PUT分別增加到69%和84%。這表明特定生態型的轉錄本較短，或者識別其他生態型中直系同源物的能力取決于轉錄本長度。

圖3. B1K基因與大麥基因相關性的對數圖

為了評估野生大麥轉錄組序列在改善栽培大麥基因組注釋方面的用途，通過使用 BLASTX預測獨特轉錄本覆蓋的編碼序列（CDS）的范圍來調查轉錄本完全或部分覆蓋大麥HC基因的數量。62%的B1K PUTs標記了45%的大麥HC基因，5%的與大麥HC基因同源的B1K PUTs完全覆蓋了HC基因。大多數較短的HC基因（即小于 1500 bp）被PUT很好地覆蓋，而較長的HC基因覆蓋則較少（圖3A和3B）。較長的HC基因比較短的HC基因比例更高，這與野生大麥的產量有關（圖3B）。此外，我們使用OrfPredictor來預測CDS。來自所有三個組件的超過 99% 的獨特轉錄本包含長度超過33個核苷酸的CDS，平均預測CDS長度為350 bp (B1K)；19%的長度超過500 bp，4%的長度超過1 kb。3.3% (584) 來自 B1K PUT 的預測CDS與它們的直系同源HC CDS具有相同的CDS長度，而2.6%（456）的CDS長度大于其同源體。（圖3C）。