近年來，三維 (3D) 培養(yǎng)模型作為一種有效的生物研究工具越來越受到認可。與傳統(tǒng)的單層培養(yǎng)系統(tǒng)相比，3D 培養(yǎng)的細胞更接近于模擬生物體的生理環(huán)境。一種廣泛使用的 3D 培養(yǎng)技術(shù)是多細胞球體的應(yīng)用。球狀體是無異物生長的微型球形細胞團。
 

2. 方案介紹

有多種方法可用于生成球體。所有可用的方法都可以防止細胞附著在培養(yǎng)皿基質(zhì)上，從而增加與鄰近細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用。在本應(yīng)用說明中，我們使用液體疊加技術(shù)來生成球體。這種方法是形成球體的最簡單的方法之一，并有幾個優(yōu)點。首先，可以生成和監(jiān)測單個球體，從而可以輕松評估生長動力學(xué)和球體特性。其次，簡單的培養(yǎng)基交換允許更長的培養(yǎng)時間。最后，不需要特殊設(shè)備。簡而言之，在加入細胞懸液之前，孔用瓊脂糖包被。除了提供非粘性表面，瓊脂糖包被的孔還增加了細胞與細胞之間的接觸，因為細胞聚集在它們的凹底上。
 

本方案用以下實驗材料：

· µ-Plate 血管生成 96 孔 ibiTreat (ibidi, 89646)

· 1% 瓊脂糖（溶于 PBS）（例如 Sigma-Aldrich Chemie GmbH，A9539）

· 胰蛋白酶或細胞分離的替代品

· 細胞培養(yǎng)基

 以下需要設(shè)備：

· 用于融化瓊脂糖的熱培養(yǎng)箱、微波或高壓釜

· 用于測定生長動力學(xué)的倒置顯微鏡

· 細胞培養(yǎng)箱（通常為 37°C、5% CO2 和 95% 相對濕度）
 

材料的制備：

1. 在 PBS 中制備 1% 瓊脂糖。

2. 用 30 µl 瓊脂糖涂抹孔。瓊脂糖形成凝膠并在 10 分鐘內(nèi)冷卻至室溫。該體積適合完全覆蓋孔的表面并產(chǎn)生凹面。

注意：瓊脂糖應(yīng)放置在溫水浴中，以防止移液過程中過早凝膠化。此外，吸頭和板應(yīng)在制備前一小時置于 50°C。
 

球體形成：

1. 像往常一樣準備細胞懸液。

2. 制定細胞數(shù)并將細胞懸浮液稀釋到所需的細胞濃度（考慮圖 1 作為參考）。

3. 將 55 µl 細胞懸浮液加入到每個孔中。

4. 在細胞培養(yǎng)箱中孵育板。

5. 在兩天的初始孵育時間后，應(yīng)每隔一天輕輕更換培養(yǎng)基。盡量減少板的移動，特別是在球體啟動期間。

6. 球體的形成和生長可以使用相差顯微鏡和球體活力進行評估，使用熒光素二乙酸酯 (FDA)/碘化丙啶 (PI) 染色，使用 FDA 和 PI 進行活/死染色”。
 

· 可以通過調(diào)整播種濃度或孵化時間來控制球體的大小和特性（圖 1）。

· 球體形成、生長動力學(xué)和球體特征取決于細胞類型（圖 2、3）。

· 血清的類型和質(zhì)量嚴重影響球體的形成和生長。

· 不規(guī)則或不充分的瓊脂糖涂層會導(dǎo)致形成幾個不規(guī)則的球體和/或每孔細胞粘附。不要讓瓊脂糖冷卻到 50°C 以下，以盡量減少分配過程中凝膠化的風(fēng)險。

· 不規(guī)則和非圓形球體的形成可歸因于培養(yǎng)基和/或血清中的小顆粒。如果需要，通過顯微鏡監(jiān)測培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補充劑，并通過無菌過濾器過濾補充培養(yǎng)基。
 

圖 2. HT-1080 和 HeLa 細胞系的球體形成和生長，在 µ-Plate Angiogenesis 96 孔中以不同的初始細胞濃度接種。 （比例尺：800 µm）

圖3.MCF-7 球體的球體生長取決于播種濃度和培養(yǎng)時間

圖4.MCF-7 球體大小與壞死中心大小之間的相關(guān)性

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