缺水抑制赤霉素積累促進番茄快速和長期的“避旱”反應

植物通過氣孔關閉和抑制冠層生長來減少蒸騰作用以避免在干旱期間脫水。雖然脫落酸 (ABA) 在“避免干旱”中起主要作用，但先前的研究表明赤霉素 (GA) 也可能參與其中。在這里，我們在番茄 (Solanum lycopersicum) 中表明，缺水會抑制 GA 生物合成基因 GA20 氧化酶1 (GA20ox1) 和GA20ox2 的表達，并在葉子和保衛細胞中誘導 GA 失活基因 GA2ox7，導致生物活性 GA 水平降低。 GA 代謝的干旱調節由 ABA 依賴性和獨立途徑以及轉錄因子 DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT BINDING (DREB)、TINY1 介導。 GA20ox1 和 GA20ox2 中的突變由于較小的冠層面積而減少了水分流失。另一方面，GA2ox7 的缺失不影響葉片大小，但減弱了氣孔對缺水的反應；在土壤脫水期間，ga2ox7 植物關閉氣孔并減少蒸騰作用的時間晚于 WT，表明 ga2ox7 氣孔對土壤脫水不敏感。總之，結果表明，干旱誘導的保衛細胞中的 GA 失活有助于土壤脫水早期階段的氣孔關閉，而葉片中 GA 合成的抑制主要促進冠層生長的長期減少以減少蒸騰面積。

使用快速有效的保衛細胞分離程序來檢查缺水是否影響保衛細胞中的 GA 積累。采取這種快速程序是為了最大限度地減少分離過程對轉錄和激素代謝的影響。番茄 M82 (WT) 植物在正常灌溉制度下生長，或暴露于缺水 [15% 土壤體積含水量 (VWC)]，然后從 3 號和 4 號葉子（自上而下）分離保衛細胞。用中性紅染色的富含保衛細胞的樣品的顯微鏡分析證實了保衛細胞的活力，但沒有證實其余表皮細胞的活力。然后我們分析了富含保衛細胞的樣品中的 GA 含量，發現缺水會顯著降低生物活性 GA GA1 和 GA3 以及 C-20 中間體 GA12 的水平（圖 1A，數據集 S1）。盡管 GA3 在植物中相當罕見（Hedden. 2020），但之前的研究表明其在番茄中的積累（Li et al. 2020）。生物活性GA4的水平遠低于GA1和GA3，在干旱處理中略高但不顯著。

圖1.干旱抑制保衛細胞和葉組織中的GA 生物合成

由于缺水會上調保衛細胞中GA2ox7 的表達，我們檢查了 GA2ox7 活性對氣孔關閉的重要性。ga2ox7 突變體最近在番茄中得到表征。該突變體具有延長的上胚軸但具有WT氣孔密度的正常葉子（圖2A）。在正常灌溉下，GA2ox7 的損失對基礎氣孔孔徑、蒸騰速率和氣孔導度沒有影響。然而，當ga2ox7 植物暴露在缺水條件下時，它們表現出的“抗旱性”降低；它們在 WT 之前枯萎并且表現出葉片相對含水量的更快下降（RWC，圖 2A 和 B）。然后我們檢查了快速失水是否是由缺水條件下較高的蒸騰速率引起的。我們分析了使用一系列蒸滲儀在溫室中生長的WT和 ga2ox7 突變植物的全株蒸騰作用。植物在灌溉下生長，然后停止供水。在干旱處理的前三天，蒸騰速率沒有受到影響（圖2C）。然而，在第4天，WT 植物的蒸騰速率急劇下降，而 ga2ox7 的蒸騰速率沒有變化。僅在第五天，ga2ox7 植物減少了它們的蒸騰作用。在 ga2ox7 之前，WT 中整株植物的每日蒸騰量也減少。我們通過熱成像進一步分析了土壤逐漸脫水過程中的蒸騰速率。在澆水良好的土壤（60% 土壤 VWC）中，WT 和 ga2ox7 的葉表面溫度相似，表明蒸騰速率相似（圖2D）。然而，當土壤脫水至 35% VWC 時，WT 葉片的溫度升高，而 ga2ox7 的溫度沒有變化，表明 WT 而不是突變體關閉了它們的氣孔。在 15% 的土壤 VWC 下，WT 和 ga2ox7 葉片表現出更高且相似的溫度，表明它們的氣孔都關閉了。顯微分析表明，在輕度缺水（35% 土壤 VWC）下，70% 的 WT 氣孔關閉，而在 ga2ox7 中只有 49%（圖2E）。最后，我們分析了不同土壤 VWC 下 WT 和 ga2ox7 植物的氣孔導度。在灌溉植物中，WT 和突變體的氣孔導度相似（圖 2F)。然而，當土壤 VWC 降低到 40% 時，WT 中的氣孔導度顯著低于 ga2ox7。在嚴重干旱（15% 土壤 VWC）下，WT 和 ga2ox7 的氣孔導度非常低且相似。這些結果表明 ga2ox7 氣孔對土壤脫水不敏感。土壤脫水過程中保衛細胞中 GA2ox7 表達的分析表明，在土壤脫水的早期階段就已經上調了（30% 土壤 VWC，圖 2G）。總之，結果表明土壤脫水早期階段的 GA 失活有助于氣孔關閉。

圖2.ga2ox7氣孔對土壤脫水不敏感

為了測試GA20ox1 和 GA20ox2的表達降低是否也會影響缺水條件下的氣孔關閉和水狀態，我們生成了 CRISPR/Cas9 衍生的 ga20ox1 和 ga20ox2 功能喪失突變體。兩種突變體都表現出較短的莖，較小的葉子，但在澆水良好的植物中具有 WT 基部氣孔孔徑（圖 3A；）。我們首先檢查了這兩個突變體的“避免干旱”。為此，我們將 WT、ga20ox1 和 ga20ox2 植物暴露于缺水 303 條件下，并分析了失水率。與 WT 相比，兩個突變體都保持了更高的葉 RWC（圖 3B），表明干旱下水分流失率降低。然后我們使用熱成像分析了蒸騰速率。在灌溉或缺水條件下，兩種突變對蒸騰速率都沒有影響（圖 3C）。此外，在土壤脫水期間，WT 和突變體之間的氣孔導度相似（圖 3D）。總之，結果表明在缺水條件下 ga20ox1 和 ga20ox2 植物中發現的水分流失率降低是由較小的葉面積引起的，而不是由更快的氣孔關閉引起的。

我們還通過雜交產生了雙突變體ga20ox1/ga20ox2。雙突變體對生長表現出累加效應；植物矮小，它們的葉子非常小。 ga20ox1/ga20ox2 背面葉表皮的顯微鏡分析顯示氣孔孔徑減少（圖 3E），類似于其他強 GA 突變體，例如穩定 DELLA 的過表達（Nir 等，2017）。與這一觀察結果一致，雙突變體的氣孔導度低于澆水良好的植物中的 WT（圖 3F）。這些結果表明 GA20ox1 和 320 GA20ox2 之間在促進氣孔關閉方面存在高度冗余，但在調節葉片生長方面沒有。GA20ox1 和 GA20ox2 在全葉組織中的表達遠高于保衛細胞（圖 3G）。這可以解釋為什么它們在葉子生長中具有重要作用，但在氣孔關閉中沒有。

圖3.GA20ox1和 GA20ox2 的損失減少了冠層生長并抑制了缺水條件下的水分流失