在自身免疫、免疫缺陷和癌癥中，受刺激的 T 細胞中細胞因子產生的調節可能會被破壞。刺激依賴性細胞因子調節劑的系統發現需要功能喪失和功能獲得研究，這在人類原代細胞中一直具有挑戰性。通過報告人類原代 T 細胞中的全基因組 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和干擾 (CRISPRi) 篩選，以識別控制白介素-2 (IL-2) 和干擾素-γ (IFN-γ) 產生的基因網絡。

CRISPR 激活與干擾篩選技術概述

《科學》雜志中關于CRISPR 激活、篩選有新進展，CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干擾 (CRISPRi) 篩選是測試基因功能得失的強大工具，但它們的使用在很大程度上僅限于永生化細胞系。Smite等人報告了一種優化方法，使他們能夠對人類原代 T 細胞進行全基因組 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選。然后，這種方法被用來檢查調節關鍵治療相關細胞因子產生的基因。然后將合并的 CRISPRa 擾動與單細胞 RNA 測序 (CRISPRa Perturb-seq) 相結合，使他們能夠探究細胞因子產生的調節劑如何控制 T 細胞活化并編程為不同的活化后狀態.

人類 T 細胞對抗原刺激的反應，包括細胞因子的產生，對健康的免疫功能至關重要，并且可能在自身免疫、免疫缺陷和癌癥中失調。系統地了解調節 T 細胞激活與功能獲得和功能喪失基因擾動的調節劑將提供對疾病途徑的更多見解，并為設計下一代免疫療法提供更多機會。

CRISPR 激活與干擾篩選的基本原理

盡管 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干擾 (CRISPRi) 篩選是在永生化細胞系中進行功能獲得和功能喪失研究的強大工具，但在原代細胞類型中大規模部署它們一直具有挑戰性。在這里，研究團隊在原代人類 T 細胞中開發了一個 CRISPRa 和 CRISPRi 發現平臺，并對響應刺激的細胞因子產生的功能調節劑進行了全基因組篩選。由于 T 細胞中內源白介素-2 (IL-2) 產生或 CD8 中干擾素-γ (IFN-γ) 產生的水平，通過熒光激活細胞分選到高和低箱中分離 CRISPRa 擾動細胞池+ T 細胞。命中包括近端 T 細胞受體 (TCR) 信號通路基因，表明這些成分的過表達可以克服信號“瓶頸”并調節刺激和細胞因子的產生。

使用 CRISPRi 的互惠全基因組功能喪失篩選檢測到具有關鍵調節功能的命中，包括 CRISPRa 遺漏的一些命中。相比之下，CRISPRa 還發現了可能不需要的命中，在某些情況下，在篩選條件下僅以低水平表達。核因子 κ B (NF-κB) 信號通路對 IFN-γ 產生的調節有力地證明了這一點，其中 CRISPRi 確定了所需的 TCR-NF-κB 信號通路（包括MALT1和BCL10）。CRISPRa 選擇性地檢測到一組也通過 NF-kB 發出信號的腫瘤壞死因子超家族受體，包括 4-1BB、CD27、CD40 和 OX40。在他們的實驗條件下，這些受體并不是單獨信號傳導所必需的，但在過度表達時可以促進 IFN-γ。因此，CRISPRa 和 CRISPRi 在功能性細胞因子調節劑的全面發現方面相互補充。陣列 CRISPRa 擾動驗證了關鍵命中對 CD4 +和 CD8 + T 細胞的影響。他們還通過測量一組分泌的細胞因子和趨化因子，評估了單個 CRISPRa 擾動如何更廣泛地重新編程 IL-2 和 IFN-γ 之外的細胞因子產生。



新平臺的開發與支持
Smite團隊還開發了一個平臺，用于在原代人類 T 細胞中結合單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 讀數 (CRISPRa Perturb-seq) 進行合并 CRISPRa 擾動。他們使用 CRISPRa Perturb-seq 對由 70 個全基因組篩選命中和對照引起的單細胞狀態進行深度分子表征，以揭示細胞因子產生的調節劑如何調節 T 細胞活化并將細胞編程為不同的刺激響應狀態。

他們的研究證明了一個強大的平臺，用于在原代人類 T 細胞中大規模匯集 CRISPRa 和 CRISPRi。成對的 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選能夠對可以調節細胞因子產生的基因網絡進行全面的功能定位。通過陣列表型分析和匯集的 scRNA-seq 方法對 CRISPRa 命中進行跟蹤，可以對關鍵篩選命中進行精確的功能表征，揭示關鍵擾動如何將 T 細胞調整到治療相關狀態。未來在原代細胞中進行的 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選可以確定改進的下一代細胞療法的目標。

研究學家Arrayed CRISPRa 確認了關鍵命中并啟用了多重分泌組表征，揭示了重塑的細胞因子反應。將 CRISPRa 篩選與單細胞 RNA 測序相結合，可以對篩選命中進行深度分子表征，揭示了擾動如何調節 T 細胞活化并促進以不同細胞因子表達譜為特征的細胞狀態。這些篩選揭示了重新編程關鍵免疫細胞功能的基因，這也為免疫療法的設計提供參考。