正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

Gu 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，不僅是組成蛋白質(zhì)的 20 種氨基酸之一，而且通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用參與多種氨基酸合成，是生物體內(nèi)主要氨基來(lái)源之一。此外，Glu 還是味精的主要有效成分，常用做食品添加劑以及香料生產(chǎn)。

測(cè)定原理：

利用專(zhuān)用提取液提取，然后用顯色劑進(jìn)行顯色，顯色后在 570nm 下進(jìn)行測(cè)定。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶， 4℃保存；臨用前加入 10mL 蒸餾水，充分混勻溶解，用不完的試劑仍 4℃保存。

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣品：
先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 1000 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 2mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 常溫離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.2g 組織，加入 2mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 常溫離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液樣品：按照血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液體積（mL）：試劑一體積(mL)為 1：5~10的比例（建議取 0.2mL 血清（漿）或者細(xì)胞培養(yǎng)液加入 2mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 常溫離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 在有蓋 EP 管中加入下列試劑：

試劑名稱（μL）  測(cè)定管   對(duì)照管

樣本 1000

試劑一 1000

試劑二 200  200

混勻，90℃水浴 20min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻，于 570nm 波長(zhǎng)處比色，△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管。谷氨酸含量計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0074x- 0.5255；x 為谷氨酸含量（µg/mL），y 為吸光值。

2、按照血清（漿）或者細(xì)胞培養(yǎng)液體積計(jì)算

谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2）=1351×(△A+0.5255)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

谷氨酸含量(µg/g 鮮重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.2×(△A+0.5255) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

谷氨酸含量(μg/104 cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，1mL；V2：加入提取液體積，2 mL；V3：加入血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液體積，0.2 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；1000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，1000 萬(wàn)。

注意：

1、該試劑盒僅適用于發(fā)酵液或組織中谷氨酸含量測(cè)定，檢測(cè)下限為 100µg/mL。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：100µg/mL -600µg/mL。

3、ΔA 線性范圍為：0.01-2；若大于 2 則需要將上清液用試劑一稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。