PCR擴增在幽門螺桿菌耐藥性分析的應用
幽門螺桿菌知多少
幽門螺桿菌是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的革蘭氏陰性細菌，1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中分離成功。世界上有約一半的人感染了幽門螺桿菌，但很多沒有臨床癥狀。幽門螺桿菌及其患病率在某些人群中高達80％。幽門螺桿菌可能通過接觸感染者的唾液、嘔吐物或糞便傳播，食用受污染的食物或水也會感染。大多數感染幽門螺桿菌的人都是在兒童時期感染的。
幽門螺桿菌感染可導致慢性胃炎、消化性潰瘍�。≒UD）、胃癌和胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤等胃腸道疾病。它還可能與非消化系統疾病有關，如口臭、身材矮小、營養不良和兒童難治性缺鐵性貧血。根除幽門螺桿菌有助于治療慢性胃炎、PUD 和其他相關疾病，并降低患胃癌的風險。
近期，重慶醫科大學附屬兒童醫院消化科主任李中躍老師課題組在歐洲兒科醫學期刊《European Journal of Pediatrics》上發表Antibiotic resistance of Helicobacter pylori isolated from children in Chongqing, China的研究論文，研究團隊對重慶地區兒童幽門螺桿菌耐藥性進行了分析。
研究背景
幽門螺桿菌 (H. pylori) 感染是人類最常見的慢性細菌感染之一，作為幽門螺桿菌的一線治療方案，標準的三聯療法包括一種質子泵抑制劑(PPI) 和兩種抗生素：克拉霉素和阿莫西林（如果對青霉素過敏，可以用甲硝唑代替阿莫西林）。首次引入該療法時，它達到了很高的根除率（> 90%）。然而，近年來該方案在世界許多地區的療效一直在下降，根除率<80%，不再適合臨床實踐。根除率低的原因可能涉及不適當的治療、患者依從性差、吸煙、CYP2C19 基因多態性和胃中的高細菌負荷。幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性通常被認為是根除失敗的主要原因。突變在幽門螺桿菌的抗生素耐藥性中起重要作用。作為最常用的大環內酯類藥物之一，克拉霉素通過可逆地與細菌23S rRNA分子50S核糖體亞基的結構域V的肽基轉移酶環結合，抑制蛋白質合成。據報道，23S rRNA 基因域 V 中的點突變與克拉霉素耐藥性相關。A2142G 和 A2143G 的點突變（transtions）是最普遍的突變。氟喹諾酮類藥物通過抑制 DNA 促旋酶的活性來干擾細菌中 DNA 的合成。幽門螺桿菌對氟喹諾酮類藥物的抗性與 gyrA 基因喹諾酮類藥物抗性決定區的點突變有關。
實驗方法
幽門螺桿菌菌株分離：重慶醫科大學兒童醫院消化內科門診對156例疑似幽門螺桿菌感染患兒進行胃活檢，在調查前的最后2個月內，所有兒童均未服用任何H2受體拮抗劑、PPI、鉍和抗生素。通過上消化道內鏡在胃竇處采集胃黏膜活檢標本，樣本經處理培養后，對疑似透明菌落通過革蘭氏染色和脲酶、過氧化氫酶、氧化酶活性試驗鑒定，然后確定幽門螺桿菌。
抗生素藥敏試驗：采用瓊脂稀釋法檢測幽門螺桿菌菌株對六種抗生素（克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、四環素和呋喃唑酮）的耐藥性。將幽門螺桿菌懸浮液接種到含有5% 羊血和臨界濃度的單一抗生素的培養板上，然后在微需氧條件下在37°C 下孵育 3 至 5 天�？股卣埸c（breakpoints）為克拉霉素≥1.0 μg/mL、甲硝唑≥8.0 μg/mL、左氧氟沙星≥2.0 μg/mL、阿莫西林≥2.0 μg/mL、四環素≥2.0 μg/mL、呋喃唑酮≥2.0 μg/mL。試驗中ACTC11637用作對照菌株。
23S rRNA 和 gyrA 基因的突變分析：
提取分離菌株的DNA，設計引物用于擴增23S rRNA 和 gyrA 基因。使用 BIO-GENER PCR 擴增儀進行PCR擴增，最后對PCR 產物進行鑒定，并進行 Sanger 測序以檢測 23S rRNA 中 2143、2142 位、gyrA 基因中 87 和 91 位密碼子的突變。
統計學分析：數據采用SPSS 26.0統計軟件進行分析。不同性別、年齡組和內鏡檢查結果的耐藥發生率采用卡方檢驗（χ2 檢驗），概率（p）值≤0.05被認為具有統計學意義。
其中，基因擴增實驗中用到的PCR擴增儀來自柏恒科技。
結果
研究顯示，共分離出112株（71.8%）幽門螺桿菌。有56名男孩和56名女孩，所有兒童的平均年齡為9.6±3.0歲，范圍為3.0至17.9歲。112例患者中，最常見的癥狀是腹痛（77.7%），內鏡下主要表現為幽門螺桿菌相關性胃炎（86.6%），僅有15例患者出現十二指腸潰瘍。在 112 個樣本中，102 個菌株檢測到 23S rRNA 和 gyrA 基因的突變。A2143G突變率為48.0%（49/102）；沒有發現任何 A2142G 突變。gyrA基因突變率為16.7%（17/102），在17株菌株中，對應Asn87和Asp91的突變率分別為9.8%（10/102）和6.9%（7/102）。研究人員還發現11株同時具有23S rRNA和gyrA基因突變。沒有觀察到 Asn87 和 Asp91 突變之間的 MIC (最低抑菌濃度)值有顯著差異(p>0.05)。
討論
許多國家都報道了兒童對克拉霉素的耐藥性，其患病率從 16.0% 到 50.9% 不等。在該研究中，克拉霉素的耐藥率為47.3%，高于中國其他地區以往報道（16.4-31.8%），但低于北京（84.9-96.6%）。歐洲的一項多中心研究分析了門診社區中抗生素使用與抗生素耐藥性之間的關系，以治療幽門螺桿菌感染，并表明長效大環內酯類藥物的使用與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性相關。在大環內酯類中也觀察到強烈的交叉耐藥性。因此，中國幽門螺桿菌感染兒童對克拉霉素的高耐藥性可能歸因于大環內酯類藥物在呼吸系統和其他疾病中的頻繁使用。 在臨床實踐中調節和限制大環內酯類的給藥可能有利于降低高耐藥性。
重慶市幽門螺旋桿菌感染兒童對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐藥率較高。大多數克拉霉素耐藥菌株均檢測到A2143G突變，而gyrA突變點的Asn87和Asp91在左氧氟沙星耐藥菌株中常見。在臨床實踐中，抗幽門螺桿菌治療應根據藥敏試驗個體化。
在今天的介紹中，我們了解了關于幽門螺桿菌耐藥一些情況及背后分子層面機理，對于我們預防和治療幽門螺桿菌提供了不少信息。分子層面研究可以用到的PCR儀簡介如下，歡迎咨詢了解更多。
PCR儀
RePure系列智能二維梯度PCR儀
本系列PCR儀具有二維梯度摸索功能，多種梯度摸索模式；
自適應壓桿式熱蓋，合蓋緊蓋一步到位；
前進后出式風道，機器可并排放置，節約實驗空間；
Q3200系列熒光定量PCR儀
本系列熒光PCR儀采用四通道雙16孔模塊設計，可實現一機多用；
最大升降溫速率8℃/s，大大節約實驗時間；
體積小，重量輕，方便攜帶；
幽門螺桿菌是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的革蘭氏陰性細菌，1983年首次從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜活檢組織中分離成功。世界上有約一半的人感染了幽門螺桿菌，但很多沒有臨床癥狀。幽門螺桿菌及其患病率在某些人群中高達80％。幽門螺桿菌可能通過接觸感染者的唾液、嘔吐物或糞便傳播，食用受污染的食物或水也會感染。大多數感染幽門螺桿菌的人都是在兒童時期感染的。
幽門螺桿菌感染可導致慢性胃炎、消化性潰瘍�。≒UD）、胃癌和胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤等胃腸道疾病。它還可能與非消化系統疾病有關，如口臭、身材矮小、營養不良和兒童難治性缺鐵性貧血。根除幽門螺桿菌有助于治療慢性胃炎、PUD 和其他相關疾病，并降低患胃癌的風險。
研究背景
幽門螺桿菌 (H. pylori) 感染是人類最常見的慢性細菌感染之一，作為幽門螺桿菌的一線治療方案，標準的三聯療法包括一種質子泵抑制劑(PPI) 和兩種抗生素：克拉霉素和阿莫西林（如果對青霉素過敏，可以用甲硝唑代替阿莫西林）。首次引入該療法時，它達到了很高的根除率（> 90%）。然而，近年來該方案在世界許多地區的療效一直在下降，根除率<80%，不再適合臨床實踐。根除率低的原因可能涉及不適當的治療、患者依從性差、吸煙、CYP2C19 基因多態性和胃中的高細菌負荷。幽門螺桿菌對抗生素的耐藥性通常被認為是根除失敗的主要原因。突變在幽門螺桿菌的抗生素耐藥性中起重要作用。作為最常用的大環內酯類藥物之一，克拉霉素通過可逆地與細菌23S rRNA分子50S核糖體亞基的結構域V的肽基轉移酶環結合，抑制蛋白質合成。據報道，23S rRNA 基因域 V 中的點突變與克拉霉素耐藥性相關。A2142G 和 A2143G 的點突變（transtions）是最普遍的突變。氟喹諾酮類藥物通過抑制 DNA 促旋酶的活性來干擾細菌中 DNA 的合成。幽門螺桿菌對氟喹諾酮類藥物的抗性與 gyrA 基因喹諾酮類藥物抗性決定區的點突變有關。
實驗方法
幽門螺桿菌菌株分離：重慶醫科大學兒童醫院消化內科門診對156例疑似幽門螺桿菌感染患兒進行胃活檢，在調查前的最后2個月內，所有兒童均未服用任何H2受體拮抗劑、PPI、鉍和抗生素。通過上消化道內鏡在胃竇處采集胃黏膜活檢標本，樣本經處理培養后，對疑似透明菌落通過革蘭氏染色和脲酶、過氧化氫酶、氧化酶活性試驗鑒定，然后確定幽門螺桿菌。
抗生素藥敏試驗：采用瓊脂稀釋法檢測幽門螺桿菌菌株對六種抗生素（克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、四環素和呋喃唑酮）的耐藥性。將幽門螺桿菌懸浮液接種到含有5% 羊血和臨界濃度的單一抗生素的培養板上，然后在微需氧條件下在37°C 下孵育 3 至 5 天�？股卣埸c（breakpoints）為克拉霉素≥1.0 μg/mL、甲硝唑≥8.0 μg/mL、左氧氟沙星≥2.0 μg/mL、阿莫西林≥2.0 μg/mL、四環素≥2.0 μg/mL、呋喃唑酮≥2.0 μg/mL。試驗中ACTC11637用作對照菌株。
23S rRNA 和 gyrA 基因的突變分析：
提取分離菌株的DNA，設計引物用于擴增23S rRNA 和 gyrA 基因。使用 BIO-GENER PCR 擴增儀進行PCR擴增，最后對PCR 產物進行鑒定，并進行 Sanger 測序以檢測 23S rRNA 中 2143、2142 位、gyrA 基因中 87 和 91 位密碼子的突變。
統計學分析：數據采用SPSS 26.0統計軟件進行分析。不同性別、年齡組和內鏡檢查結果的耐藥發生率采用卡方檢驗（χ2 檢驗），概率（p）值≤0.05被認為具有統計學意義。
其中，基因擴增實驗中用到的PCR擴增儀來自柏恒科技。
結果
研究顯示，共分離出112株（71.8%）幽門螺桿菌。有56名男孩和56名女孩，所有兒童的平均年齡為9.6±3.0歲，范圍為3.0至17.9歲。112例患者中，最常見的癥狀是腹痛（77.7%），內鏡下主要表現為幽門螺桿菌相關性胃炎（86.6%），僅有15例患者出現十二指腸潰瘍。在 112 個樣本中，102 個菌株檢測到 23S rRNA 和 gyrA 基因的突變。A2143G突變率為48.0%（49/102）；沒有發現任何 A2142G 突變。gyrA基因突變率為16.7%（17/102），在17株菌株中，對應Asn87和Asp91的突變率分別為9.8%（10/102）和6.9%（7/102）。研究人員還發現11株同時具有23S rRNA和gyrA基因突變。沒有觀察到 Asn87 和 Asp91 突變之間的 MIC (最低抑菌濃度)值有顯著差異(p>0.05)。
討論
許多國家都報道了兒童對克拉霉素的耐藥性，其患病率從 16.0% 到 50.9% 不等。在該研究中，克拉霉素的耐藥率為47.3%，高于中國其他地區以往報道（16.4-31.8%），但低于北京（84.9-96.6%）。歐洲的一項多中心研究分析了門診社區中抗生素使用與抗生素耐藥性之間的關系，以治療幽門螺桿菌感染，并表明長效大環內酯類藥物的使用與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性相關。在大環內酯類中也觀察到強烈的交叉耐藥性。因此，中國幽門螺桿菌感染兒童對克拉霉素的高耐藥性可能歸因于大環內酯類藥物在呼吸系統和其他疾病中的頻繁使用。 在臨床實踐中調節和限制大環內酯類的給藥可能有利于降低高耐藥性。
重慶市幽門螺旋桿菌感染兒童對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐藥率較高。大多數克拉霉素耐藥菌株均檢測到A2143G突變，而gyrA突變點的Asn87和Asp91在左氧氟沙星耐藥菌株中常見。在臨床實踐中，抗幽門螺桿菌治療應根據藥敏試驗個體化。
在今天的介紹中，我們了解了關于幽門螺桿菌耐藥一些情況及背后分子層面機理，對于我們預防和治療幽門螺桿菌提供了不少信息。分子層面研究可以用到的PCR儀簡介如下，歡迎咨詢了解更多。
PCR儀
本系列PCR儀具有二維梯度摸索功能，多種梯度摸索模式；
自適應壓桿式熱蓋，合蓋緊蓋一步到位；
前進后出式風道，機器可并排放置，節約實驗空間；
本系列熒光PCR儀采用四通道雙16孔模塊設計，可實現一機多用；
最大升降溫速率8℃/s，大大節約實驗時間；
體積小，重量輕，方便攜帶；
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