qPCR實(shí)驗(yàn)中引物設(shè)計(jì)的詳細(xì)步驟介紹
如何成為qPCR高手?
今天要講的是引物篇。
“擎科小講堂”上周推出了qPCR高手養(yǎng)成記第一期干貨文章：耗材篇。大家呼聲很高，紛紛“催更”。本周我們將推出第二篇干貨內(nèi)容：引物篇，圖文解析引物設(shè)計(jì)，助力實(shí)驗(yàn)高效完成！
qPCR實(shí)驗(yàn)中，引物設(shè)計(jì)是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，引物的合適與否與擴(kuò)增效率是否達(dá)標(biāo)、擴(kuò)增產(chǎn)物是否特異、實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可用等息息相關(guān)。
您是不是在qPCR引物設(shè)計(jì)中感到困惑：如何使引物特異性佳？有沒(méi)有什么一勞永逸的方法？
在設(shè)計(jì)qPCR引物時(shí)，通常要留意以下幾點(diǎn)：
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引物盡量要跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)
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產(chǎn)物長(zhǎng)度100-300 bp
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TM值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近
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引物末端是G或C
這么多的點(diǎn)要留意怎么辦？今天擎小科帶您一起五步搞定qPCR引物設(shè)計(jì)，讓qPCR引物設(shè)計(jì)成為你的絕殺技能。
第一步：查詢(xún)基因
通過(guò)NCBI查詢(xún)Homo GAS6的基因，這里要注意對(duì)比基因名稱(chēng)、種屬，確保都要一致。
2.進(jìn)入后，點(diǎn)擊如下表的“CDS”，棕色背景序列即為該基因的編碼序列。
2.在左上方輸入基因序列號(hào)或Fasta格式的序列，填寫(xiě)好相關(guān)參數(shù)。
3.點(diǎn)擊“Get primers”NCBI就會(huì)彈出來(lái)告訴你，這樣的參數(shù)選擇會(huì)擴(kuò)增到其他剪切變體，我們勾選不同的剪切變體并提交，就可以獲得合適的引物對(duì)了！（如下圖）
這些引物對(duì)的退火溫度，都在60℃左右。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇長(zhǎng)度適中、特異性好和引物自身互補(bǔ)較少的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，成功率還是相當(dāng)高的呢！
第四步：引物特異性驗(yàn)證
Primer-Blast除了可以設(shè)計(jì)引物外，還可以對(duì)我們自己設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評(píng)價(jià)。返回引物設(shè)計(jì)的頁(yè)面，輸入我們?cè)O(shè)計(jì)好的上下游引物，其它參數(shù)不調(diào)整，提交后就可以看到這對(duì)引物是否在其它基因上也存在啦，如果全部都顯示在我們想要擴(kuò)增的基因中，說(shuō)明這對(duì)引物的特異性棒棒噠！(舉例引物查詢(xún)結(jié)果只此一條噢！）
引物的擴(kuò)增效率達(dá)到90%-110%即認(rèn)為擴(kuò)增效率較好，熔解曲線(xiàn)單峰且通常Tm>80℃即認(rèn)為擴(kuò)增特異性較好。相當(dāng)簡(jiǎn)單有木有啊～是不是感覺(jué)自己已經(jīng)告別科研小白的身份，瞬間掌握了qPCR引物設(shè)計(jì)的絕招啦。
如果您在引物設(shè)計(jì)中遇到問(wèn)題，來(lái)擎科！
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擎科生物基于多年qPCR檢測(cè)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)常見(jiàn)人源細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)基因進(jìn)行了系統(tǒng)性的qPCR引物驗(yàn)證，經(jīng)多次篩選驗(yàn)證，可提供擴(kuò)增效果好、特異性高的引物庫(kù)套裝，助您的實(shí)驗(yàn)事半功倍。訂購(gòu)5對(duì)引物即可贈(zèng)送500 µL 2×qPCR Mix。
