6000Plus智能圖像工作站在“眼病近視進展“相關研究中的應用

瀏覽次數：3451　發布日期：2022-8-12　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

導言：近視已成為影響全球人口健康和國家經濟增長的主要問題，亞太地區-中國的城市人口的青少年近視發病率約67%（WHO,2019.10）。隨著智能手機和流媒體短視頻普及，長時間“近距離“或低光亮環境” 中使用數顯電子屏設備極有可能帶來視覺疲勞和輕度近視等癥狀，一旦病理性近視發展，失明的風險就會大大增加因此，重要的是控制和預防青少年和兒童近視進展的速度，以降低由于高度近視并發癥引起的失明和殘疾率。

近期，北京大學眼科臨床研究中心和北京視網膜和脈絡膜疾病診斷與治療重點實驗室的王凱(Wang_Kai)老師團隊在Karger旗下的雜志《Ophthalmic Research》發文闡述咖啡因合成代謝中間體-甲基黃嘌呤（7-Methylxanthine）通過介導ADORA2A-DRD2受體途徑影響視網膜上皮RPE細胞受體蛋白ADORA2A-DRD2二聚體通路的分子調節機制。

7-甲基黃嘌呤（C6H6N4O2, MW=166.14）是咖啡因和可可堿的天然合成代謝物，已被證明具有抑制和預防近視進展的潛力。在細胞活動的分子水平研究中，7-甲基黃嘌呤是一種非選擇性腺苷受體拮抗劑，靶向4種腺苷受體亞型（ADORA1、ADORA2A、ADORA2B和ADORA3），它們廣泛分布在眼睛的各種組織中，包括視網膜、脈絡膜和鞏膜。RPE在將視網膜生長信號傳遞給脈絡膜和鞏膜方面起著關鍵作用。

近視（Myopia) 形成的最重要機制之一是受近視影響的視覺信號從神經視網膜轉移到RPE上皮細胞，其中液體交換允許分子信號從視網膜和脈絡膜層傳遞到鞏膜，然后進行鞏膜重塑。動物模型研究表明，近視與視網膜多巴胺（多巴胺）水平的變化有關。多巴胺被認為是一種視網膜神經遞質，參與控制視覺引導的眼睛生長的信號級聯反應。哺乳動物和非哺乳動物模型研究表明，多巴胺在近視的發展中起著關鍵作用。7-MX抑制人RPE細胞中ADORA1和ADORA2s的表達，這可能改變多巴胺或其他與近視相關的神經遞質的表達。腺苷和多巴胺在中樞神經系統中相互作用，并且有研究者認為紋狀體中存在 #ADORA2A-DRD2 異源二聚體蛋白，但其作用機制未明，該文旨在探討人RPE（視網膜上皮細胞）細胞中是否存在ADORA2A-DRD2異源二聚體，以及7-MX是否可能通過ADORA2A-DRD2通路影響近視進展以及7-MX治療后細胞信號轉導過程中信號分子表達的變化，為有效藥物靶點的鑒定和近視藥物的開發提供線索。

實驗方法 為了評估人RPE細胞中是否存在ADORA2A-DRD2異源二聚體，研究者將RPE細胞在存在或不存在7-MX的情況下體外培養。使用CCK-8測定評估細胞增殖。凋亡和壞死率通過膜聯蛋白V-FITC/碘化丙啶染色和流式細胞術測定。使用免疫熒光和共免疫沉淀來檢查RPE細胞中ADORA2A和DRD2的蛋白表達和共定位。ADORA2A和DRD2被小干擾RNA（siRNA）處理后的人視網膜上皮細胞, 通過蛋白質印跡分析（使用博鷺騰BLT Gelview 6000Plus多色熒光系列智能圖像工作站）來分析多巴胺受體DRD2下游信號分子ERK1/2和磷酸化ERK1/2（pERK 1/2）的蛋白質表達的變化。

結果免疫印記（WB）、免疫熒光（IFC）和免疫共沉淀（Co-IP）都表明，ADORA2A和DRD2在RPE細胞中共定位（Fig1a-b-c）。免疫印跡顯示，通過siRNA處理下調ADORA2A蛋白表達48 h后，DRD2的蛋白表達增加(Fig2a）。此外，免疫印跡顯示用50μmol/L 7-MX處理48小時后，DRD2蛋白表達升高，RPE細胞中ADORA2A蛋白表達降低（Fig2b）。

用50 μmol/L 7-MX處理48 h后，發現DRD2、下游通路的ERK1/2和pERK1/2蛋白的表達也有所增加(Fig3-a)。在siRNA處理介導的RPE細胞中敲低DRD2水平并用50μmol/ L 7-MX進一步處理48小時后，DRD2的蛋白表達水平幾乎恢復到在天然對照中觀察到的水平（Fig3-b）。在本實驗的藥物濃度下，7-MX和siRNA不影響人RPE細胞的增殖或凋亡。（Fig2-d）

結論 ADORA2A和DRD2異源二聚體存在于RPE細胞中。7-MX可能通過ADORA2A-DRD2受體途徑影響RPE細胞的行為。7-MX是一種ADORA2A受體抑制劑，可以防止DRD2受體通路的抑制并增加DRD2受體通路活性。這種現象進一步解釋近視發展相關的視網膜上皮細胞膜RPE細胞相關蛋白通路的分子調節機制。發現通過ADORA2A-DRD2通路影響近視進展以及7-MX治療后細胞信號轉導過程中信號分子表達的變化，為潛在有效藥物靶點的鑒定和近視藥物的開發提供線索。