大腦是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的器官之一，主要功能與其微區(qū)的分子相互作用密切相關(guān)。不同代謝物在不同部位有特征性表達(dá)。傳統(tǒng)分析技術(shù)受樣品制備分辨率以及分析靈敏度的限制，無(wú)法精準(zhǔn)獲取靶向微區(qū)部位，而對(duì)其中特異微區(qū)代謝物的差異表達(dá)分析就更加困難。
  在微區(qū)樣品在制備過(guò)程中面臨的一個(gè)主要問(wèn)題就是如何在盡量避免或減少對(duì)細(xì)胞代謝的影響，其中一種方法就是在制備過(guò)程中將細(xì)胞盡可能地維持在天然環(huán)境中。組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)等的發(fā)展而得到廣泛的應(yīng)用，而激光顯微切割 (LMD, Laser Microdissection)技術(shù)可以方便地對(duì)特定的組織區(qū)域的精確分離（圖1）。
  圖1. 徠卡激光捕獲顯微切割采用移動(dòng)激光的顯微切割技術(shù)。徠卡顯微系統(tǒng)采用高精確度的光學(xué)部件并借助棱鏡沿著組織上所需的切割線對(duì)激光束進(jìn)行操縱，可垂直于組織實(shí)施切割，從而獲得切割精確、無(wú)污染的分離體。

相比DNA和RNA，細(xì)胞內(nèi)的代謝物無(wú)法擴(kuò)增，組織微區(qū)內(nèi)提供的用于分析的代謝物濃度低體積小，一些極為稀少的代謝物需要更加靈敏的檢測(cè)方法。SCIEX 7500 系統(tǒng)是SCIEX的新一代高端定量工作平臺(tái)。在繼承以往產(chǎn)品耐用性的同時(shí)，SCIEX 7500系統(tǒng)靈敏度的提高可以應(yīng)對(duì)諸如腦組織微區(qū)代謝組學(xué)這些極具挑戰(zhàn)性的分析工作。
 
 
由制備好的腦組織切片樣本置于激光顯微切割載物臺(tái)，確定好焦距平面后，將視野移動(dòng)到空白區(qū)域，進(jìn)行激光切割位置校準(zhǔn)，再將視野移動(dòng)到待切割的細(xì)胞區(qū)域；選擇合適的切割區(qū)域 (實(shí)驗(yàn)中切割面積為約2000 µm2)，在調(diào)節(jié)好相關(guān)參數(shù)后開(kāi)始進(jìn)行切割（圖2）。
  圖2. 腦組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。在40倍放大視野中選取合適的面積，約2000 µm2（左）進(jìn)行切割分離并用于后續(xù)分析；一份樣品切割分離完成后（右），可繼續(xù)選擇其他區(qū)域進(jìn)行操作。

高覆蓋靶向脂質(zhì)組學(xué)分析

該方法提供了眾多的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple reactions monitoring, MRM)離子對(duì)用于多種脂類(lèi)物質(zhì)的靶向檢測(cè)。化合物列表中可以檢測(cè)約1900種脂質(zhì)分子，可以充分覆蓋哺乳動(dòng)物的血漿、組織和細(xì)胞中的常見(jiàn)脂質(zhì)。另外，針對(duì)特定的待測(cè)物質(zhì)，也可直接在MRM列表中添加其它想要檢測(cè)分析的脂質(zhì)化合物離子對(duì)。在分離的微量細(xì)胞中共檢測(cè)到285個(gè)脂質(zhì)化合物，包括鞘脂SM、膽固醇酯CE、甘油三酯TAG、甘油二酯DAG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰膽堿PC、神經(jīng)酰胺Cer7類(lèi)（圖3）。
  圖3. 腦組織微區(qū)中測(cè)得的不同種類(lèi)脂質(zhì)化合物的數(shù)量。基于LC-MS/MS的靶向脂質(zhì)組學(xué)方法快速分析基質(zhì)中的多種脂類(lèi)物質(zhì)。

對(duì)于痕量細(xì)胞中檢測(cè)到的脂質(zhì)化合物的判定，基于與空白提取溶劑（陰性對(duì)照）和血漿脂質(zhì)提取樣本（陽(yáng)性對(duì)照）共同比較，并且結(jié)合各類(lèi)脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置情況、同類(lèi)脂質(zhì)化合物有較為接近的出峰位置，而同類(lèi)脂質(zhì)化合物連接脂肪酸鏈越長(zhǎng)保留時(shí)間越靠后、連接相同碳數(shù)的脂肪酸鏈上不飽和鍵數(shù)越多保留時(shí)間越靠前的規(guī)律，對(duì)微量樣本中檢出的脂質(zhì)化合物做定性判斷（圖4）。
 

圖4. 微量腦組織切片中測(cè)得的脂質(zhì)化合物示例圖。通過(guò)LC-MS/MS測(cè)得的7類(lèi)脂質(zhì)化合物在空白提取溶劑中（左）均不存在，而與陽(yáng)性對(duì)照血漿樣本（右）中出峰行為一致。

通過(guò)徠卡激光切割顯微鏡LMD7精確獲取微量樣本技術(shù)與SCIEX 7500系統(tǒng)高靈敏度檢測(cè)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)從空間形態(tài)到微量細(xì)胞高覆蓋靶向脂質(zhì)組學(xué)分析檢測(cè)。在約2000 µm2 組織切片樣品中檢測(cè)到脂質(zhì)化合物數(shù)目285個(gè)，符合組學(xué)分析對(duì)化合物覆蓋度的需求。