免疫熒光染色故障排除方法操作詳解

瀏覽次數：1735　發布日期：2022-8-24　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

故障排除：

免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，需要大量的經驗和優化。說明中的微小變化可以顯著改變結果。如果您收到低信號、無信號或高背景，請參閱以下故障排除建議。

高背景

原因	解決方案
不適當或過長的固定，導致偽影	減少固定時間或更換固定劑
封閉不足	延長孵育時間，考慮使用不同的封閉溶液（我們建議使用來自二抗宿主的血清）
一抗無特異性	在所選模型系統中使用經證明可用于免疫熒光的一抗；如果可用，使用敲低/敲除樣本作為陰性對照
一抗/二抗濃度過高、孵育時間過長、孵育溫度過高	優化抗體濃度和孵育時間/溫度，咨詢制造商的協議
二抗的交叉反應	使用二抗的同種型對照來檢查交叉反應性
洗得不夠	驗證所有洗滌步驟是否正確執行；如有必要，延長洗滌步驟
成像過程中的漂白	使用與適合您選擇的顯微鏡技術的熒光團偶聯的二抗
低信號強度，導致噪音	優化信噪比，例如，通過使用更亮的熒光團進行檢測；如果適用，增加目標抗原的表達（例如，通過過表達或通過添加誘導劑）
高自發熒光	使用未染色的對照檢查樣品的自發熒光；使用新鮮的固定溶液（過期的福爾馬林溶液可能具有較高的自發熒光）；使用自發熒光低的材料（例如，ibidi µ-Slides或Chamber Slides）；使用自發熒光低的封固劑（例如，ibidi封固劑 / ibidi 封固劑與 DAPI）

ibidi解決方案

具有用于倒置顯微鏡檢查的蓋玻片底部的 ibidi μ-Slides 和 μ-Dishes有多種幾何形狀可供選擇，可滿足您對免疫細胞化學的任何特定需求。所有免疫熒光染色步驟都可以直接在載玻片或培養皿中進行。

ibidi通道載玻片的幾何形狀非常適合精確交換少量中等量，這在免疫細胞化學染色過程中是必需的。此外，通道 µ-Slides 的蓋玻片底部無需額外的蓋玻片。

在 ibidi腔室載玻片中，帶有可移除腔室的硅膠墊圈安裝在標準載玻片上。載玻片非常適合長期儲存裝有蓋玻片的樣品。

低信號或無信
低信號或無信號

原因	解決方案
樣品干燥	始終保持樣品濕潤
樣品過度固定，導致表位損傷	減少固定時間或更換固定劑
透化方法不足	優化或跳過通透步驟
一抗不與感興趣的抗原結合	在所選模型系統中使用經證明可用于免疫熒光的一抗；通過使用陽性對照檢查抗體功能（例如，通過過表達或通過添加誘導劑）
一抗/二抗稀釋度太高、孵育時間太短、孵育溫度太低	增加抗體濃度或孵育時間/溫度；咨詢制造商的協議
非常低或沒有抗原表達	使用陽性對照（例如，過表達模型）；重新考慮你的實驗系統
不適當的顯微鏡檢測方法	使用更靈敏的圖像采集方法；檢查您使用的濾光片/激光設置；使用更亮的熒光團進行檢測