作為細胞中的“回收站”，溶酶體在維持細胞穩態上發揮著至關重要的作用，小優曾經為大家介紹過溶酶體降解（自噬）與神經退行性疾病的關系，感興趣的小伙伴們請戳這兒了解。 

本文想帶大家將焦點從溶酶體降解轉移到溶酶體膜上，在溶酶體膜上也存在多種不同類型的蛋白質，包括離子通道、轉運體、結構蛋白、酶等, 其中離子通道蛋白由于他們在溶酶體離子動態平衡和跨膜轉運、溶酶體膜電位和pH以及細胞營養代謝水平的調控中的重要作用, 受到越來越多的關注。
 

圖1.溶酶體膜上的部分相關蛋白質

早在2013年，賓夕法尼亞大學Dejian Ren課題組就在《Cell》上發表了對溶酶體膜表面離子通道TPCN1和TPCN2的相關研究，解釋了兩個通道如何通過感應細胞外的饑餓環境（如氨基酸缺乏）來增強溶酶體功能，從而更好地利用溶酶體降解來回收生物大分子（如氨基酸），從而維持細胞的存活。除此之外，TMEM175、TRPM1、TRPM2、CLCN、CLCN35等都是溶酶體膜上的熱門離子通道/轉運體靶標。

近年來，TMEM175對帕金森綜合征（PD）的影響越來越受到研究者們的關注。2021年發表于《Nature》期刊，及今年6月發表于《Cell》期刊的兩篇文章均對這個與PD相關的溶酶體膜離子通道靶點進行了研究，下面小優就為大家來詳細剖析這兩篇文章。
 

圖2. TMEM175是溶酶體在生理酸性條件下氫離子激活通道，通過介導溶酶體氫離子外排來維持穩定細胞內pH的穩定狀態

PART ONE: 生長因子通過調控溶酶體鉀離子通道參與帕金森病變

該文章揭示了TMEM175會與蛋白激酶protein kinase B (AKT) 形成一種神經元溶酶體復合型鉀離子通道，通過感受胞外生長因子，將胞外信號分子與溶酶體的功能聯系起來，并且該通道的激活不依賴于激酶的催化活性。

作者首先驗證了生長因子（胰島素、NGF、BDNF）可以激活饑餓狀態下小鼠原代海馬神經元中的溶酶體鉀離子通道。如圖三所示，細胞轉染TMEM175且饑餓后，鉀離子電流就消失了（圖3），而通過喂養三種生長因子，消失了的鉀離子電流會重新出現。另外，如果在小鼠的原代海馬神經元細胞中進行TMEM175基因敲除，鉀離子電流也會相應的消失。

圖3.溶酶體鉀離子通道可以被生長因子激活

該結果說明了TMEM175會參與通道孔的形成，介導溶酶體鉀離子通道。同時這個結果也暗示了生長因子或許可以間接性地通過其受體的靶點，如AKT，來激活TMEM175。因此，作者接下來又對AKT對TMEM175及對溶酶體鉀離子通道的激活及調控進行了相關的細胞實驗。

如圖4和圖5，多個細胞實驗證明AKT對溶酶體鉀離子通道的生成是必要的。且這些實驗中的免疫沉淀結果也顯示了TMEM175和AKT之間有相互作用，這或許說明了兩者之前可以形成一種復合物，而這種復合物對于溶酶體鉀離子通道的形成是至關重要的。

圖4.AKT可以充分激活TMEM175

圖5.AKT可以通過與溶酶體鉀離子通道的相互作用機制激活TMEM175

實驗進行到這里已經表明AKT對于TMEM175的激活是必要的，那么是否需要依賴AKT的激酶活性來對TMEM175進行激活呢？答案是否定的，圖6就描繪了僅需要AKT構象的改變，就可以使得TMEM175被激活，更多的實驗細節請大家參考文獻。

圖6. AKT的構象改變即可以對TMEM175通道進行激活（GF=growth factors）

接著，作者又研究了TMEM175的兩種常見的次要等位基因（minor allele）rs34311866和rs34884217，分別對應的是TMEM175通道的M393T和Q65P兩種突變。據研究，前者的變異與PD發病與進展呈正相關，而后者則呈負相關。

如圖7（d）的電生理結果可以發現（M393T突變），相較于野生型模型，突變型模型的電流有著顯著降低（基礎細胞降低43%和sc79激活細胞降低54%）。而對于Q65P突變，野生型樣本遭受饑餓3小時后電流消失，突變型樣本則在6小時后才會完全消失（圖6），說明突變后的模型對胞外生長因子的耐饑餓能力明顯更強。

這些結果表明兩種突變——M393T和Q65P——類型不同，前者是溶酶體鉀離子通道功能喪失型的突變而后者則是功能獲得型的突變。同時該文章的補充數據中也顯示了，相較于野生型，TMEM基因敲除后的神經元對于神經毒素（MPTP）等惡劣條件的抵御性明顯降低，而Q65P的突變模型則可以抵御這種損傷，進一步說明了這類溶酶體鉀離子通道對神經具有保護作用。

圖7.常見的與帕金森病易感性相關的TMEM175突變（M393T和Q65P）對溶酶體鉀離子通道的雙向調節作用。

那么該研究中的這種溶酶體鉀離子通道如何與帕金森疾病相關呢？Alpha-Synuclein（α-突觸核蛋白，α-syn）積累是PD的標志性病癥之一。如圖8所示，通過免疫熒光及組化實驗，作者觀察到TMEM175敲除后的小鼠有明顯的α-syn累積，TMEM175部分降低的樣本（約降低50%）也會加速這種蛋白的聚集。這些結果表明TMEM175的缺失會損害小鼠多巴胺能神經元和其運動能力。

圖8.溶酶體鉀離子通道的缺乏可導致小鼠致病性α-syn擴散加速、多巴胺能神經元喪失和運動功能受損。

該文章還進行了臨床上的驗證（圖9），結果顯示攜帶有M393T突變的帕金森病人明顯具有更低的認知和運動能力（相較于無此突變的病人）。

圖9.M393T突變對帕金森病病程的臨床研究結果

PART TWO: 與帕金森疾病相關的TMEM175屬于溶酶體氫離子通道

 
今年6月份，該文章的團隊發現，在生理酸性的條件下，通過TMEM175的離子主要為氫離子，而非鉀離子，并通過一系列的定量分析發現，TMEM175在該條件下對于氫離子的通透性是鉀離子的約5萬倍之多。

該作者對于這一研究的靈感來源于曾經的一個發現：在對細胞內溶酶體膜直接進行電生理記錄時，只要仿照生理條件，溶酶體膜內外存在pH差別（膜外為pH=7.2的中性環境，膜內為pH=4.6的酸性環境），就總是能夠記錄到從膜內流向膜外的特異性微弱電流。假如將膜內pH調整為更加酸性的3.5，這一信號會更加強烈。

基于此發現，作者做了如下的大膽假設：介導該電流的離子通道即是科學界正在尋找的溶酶體膜上的氫離子通道，與V-ATPase質子泵互相配合，一進一出，共同調節溶酶體的pH平衡。

因此，為了找出這一想要的氫離子通道，作者對一系列可能的溶酶體膜蛋白（除TMEM175外，還有TPC1/TRPML1/CLCN4/CLN8等）進行了逐一的過表達測試（圖10）。發現只有在TMEM175過表達的時候，所記錄到的電流比其他膜蛋白高出20倍左右。同時，被基因敲除后的樣本，即使將pH設定在更低值（3.5）也沒有可觀察的電流。這些結論表明初步驗證了TMEM175就是想要尋找的溶酶體氫離子通道。

圖10. TMEM175對于溶酶體質子激活的質子滲透電流是必要且充分的.

研究進行到這里，發現了與之前研究相悖的結論，即前期研究普遍認為TMEM175是一個鉀離子通道，接著該文章對兩者的差異又做了進一步的研究。經過仔細對比發現，先前的文獻沒有針對pH對TMEM175功能的調節作用進行考慮，因此會認為TMEM175主要通透的是鉀離子。

因此作者又進行了一系列的將溶酶體內部環境設置在跟接近生理條件pH環境的研究（如圖11），發現TMEM175在該pH條件下，具有更強的的氫離子通透性（大約是鉀離子的5萬倍）。
 

圖11.TMEM175通道具有很強的質子通過性

除此之外，該研究還鑒定出小分子化合物DCPIB和ML 67-33也可以激活TMEM175通道。這些化合物不僅能在酸性條件下激活通道的氫離子電流，在中性條件下也同樣可以激活鉀離子電流（圖11）。除此之外,研究還發現脂質分子花生四烯酸（Arachidonic Acid, ArA）是TMEM175通道的內源激活劑，說明脂質信號通路也很可能對TMEM175的活性存在調節作用。

圖12.花生四烯酸（ArA）和合成化學物質可以激活TMEM175

在細胞水平上，研究發現進行TMEM175基因敲除后的細胞內溶酶體的pH穩態被破壞，此時的溶酶體處于一種酸性過強的狀態，并通過免疫細胞實驗發現溶酶體內部的蛋白水解酶Cathepsin B和Cathepsin D的活性也因此受到影響（圖13）。
 

圖13. 通過TMEM175的質子滲透是溶酶體pH平衡和有效的蛋白水解降解所必需的

接著研究者從細胞層面衍生至小鼠生物體內，構建了TMEM175基因敲除的動物模型，如圖14所示，在小鼠神經元組織中也同樣觀察到了溶酶體酸性過強、溶酶體降解功能受損的現象。同時，與神經退行性疾病帕金森癥致病相關的α-Synuclein（前文提到）聚積現象在TMEM175基因敲除小鼠中也更為顯著，從而推測會對PD的病癥造成進一步的影響。
 

圖14. 小鼠神經元TMEM175的缺乏會導致溶酶體過度酸化，溶酶體水解活性受損，以及小鼠大腦中的α-Synuclein核蛋白的聚積

兩篇文章都為PD的研究提供了更廣闊的思路，特別是第二篇，揭示了TMEM175是一種新型的氫離子激活的氫離子通道。近年來，研究者在帕金森綜合征的病人體內普遍檢測到了TMEM175基因的突變，未來，小優預測會有更多的圍繞TMEM175調節機制，以及TMEM175如何影響神經退行性模型的精彩研究被陸續發表。

同時，不少研究團隊也正在研發用于調控溶酶體離子通道包括TRPML1和TMEM175在內的靶向藥物，將來可能用于預防和治療與溶酶體代謝降解相關的神經退行性疾病，如帕金森癥、阿爾茨海默病等。