10×單細胞轉錄組常見Q&A（三）：數據質控專題
指標一
原始數據質控
單細胞轉錄組測序獲得的原始數據為 fastq（或為壓縮文件 fq.gz）格式，每個樣本有 read1.fastq.gz 和 read2.fastq.gz兩個文件，其中read1 為 barcode 和 UMI 信息，read2 為測序的 RNA 序列信息，后續根據序列標簽信息可進行數據拆分及定量。在數據分析過程中，我們首先需要對下機的原始數據進行一系列嚴格的質控，去除掉低質量數據，保留高質量數據以確保后續數據分析結果的真實性及可靠性。FastQC軟件可以快速對測序數據進行整體統計及質量評估，直觀地反映出測序數據的好壞。
Q：單細胞轉錄組推薦的測序數據量是多少？
答：中科使用Single Cell 3' V3.1版試劑盒，官方建議最低測序量20K reads/cell。目前，中科提供的數據量默認為90G/樣，客戶可依據具體的實驗目的決定數據量的多少。
Q：如何判斷測序數據的好壞？
答：通過計算每個堿基的質量值，對測序的read 進行質量評估。堿基質量值 Q= -10×Log10(P)，在生物物理學中是堿基識別出錯概率的整數映射，用于分析每個堿基被識別錯誤的概率，其值越高表明堿基識別越可靠。質控標準中的 Q20 表示該堿基錯誤的概率為 0.01，Q30 表示錯誤率為0.001。一般Q20在85%以上，Q30在80%以上視為測序質量較好。
指標二
細胞過濾
我們在做單細胞測序的時候，首先要做細胞分離。分離條件對某些類型的細胞不適應，造成細胞破碎或凋亡，RNA溢出，導致線粒體基因比例上升，會干擾細胞分群。因此，在Cell Ranger 生成表達矩陣之后，還需要進一步對細胞進行過濾。
Q：如何判定線粒體的過濾標準？
答：細胞本身就需要能量，所以必然含有一定的線粒體基因。線粒體過濾的原則為，去除線粒體基因含量過高的細胞，但不能大量丟失樣本的細胞信息。目前統計的文章線粒體過濾閾值在5%~30%之間不等，但是一些特殊樣本，如腫瘤組織、心臟樣本、肌肉樣本，因其本身的線粒體含量偏高，固定閾值篩選原則顯然是不合適的，故而此標準需要進行調整。
目前，中科關于線粒體過濾采用絕對中位差（Median Absolute Deviation，MAD）。
絕對中位差是一種統計離差的測量。而且，MAD是一種魯棒統計量，比標準差更能適應數據集中的異常值。對于標準差，使用的是數據到均值的距離平方，所以大的偏差權重更大，異常值對結果也會產生重要影響。對于MAD，少量的異常值不會影響最終的結果。且MAD是一個比樣本方差或者標準差更魯棒的度量，對于不存在均值或者方差的分布效果更好。
指標三
多樣本批次矯正
當涉及多個樣本進行比較分析時，需要對這些樣本進行合并分析和批次矯正。目前，中科采用 Harmony 方法對scRNA 數據進行多樣本合并和批次效應的校正。
圖1 Harmony原理圖
Harmony原理：利用PCA將轉錄組表達譜嵌入到低維空間中，不同顏色表示不同數據集，不同形狀表示不同的細胞類型，然后應用迭代過程去除數據集特有的影響。
A. Harmony概率性地將細胞分配給cluster，從而使每個cluster內數據集的多樣性最大化；
B. Harmony計算每個cluster的所有數據集的全局中心，以及特定數據集的中心；
C. 在每個cluster中，Harmony基于中心為每個數據集計算校正因子；
D. 最后，Harmony使用基于C的特定于細胞的因子校正每個細胞。由于Harmony使用軟聚類，因此可以通過多個因子的線性組合對其A中進行的軟聚類分配進行線性校正，來修正每個單細胞。
重復步驟A到D，直到收斂為止。聚類分配和數據集之間的依賴性隨著每一輪的減少而減小。
Harmony算法與其他整合算法相比的優勢：
（1）整合數據的同時對稀有細胞的敏感性依然很好；
（2）適合于更復雜的單細胞分析實驗設計，可以比較來自不同供體，組織和技術平臺的細胞。
總結
本期分享到這里就結束啦，通過這三期Q&A內容的學習，相信各位老師對單細胞轉錄組已經有了比較深入的了解，以及如何將單細胞技術應用于自己的課題也有了明確的方向。中科新生命單細胞多組學相關產品持續熱銷中，歡迎感興趣的老師前來咨詢。
參考文獻
[1] Korsunsky I , Fan J , Slowikowski K , et al. Fast, sensitive, and flexible integration of single cell data with Harmony[J]. Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(12).
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